《Agronomy》：Advances in the Molecular Regulatory Network of Low-Temperature Tolerance in Maize: Key Genes, Hormones, Signaling Pathways, and Genetic Improvement Strategies
玉米（*Zea mays* L.）是全球重要的作物，但其对冷胁迫的敏感性导致温带地区产量大幅损失，低温（尤其是低于10 °C）严重制约了高海拔和高纬度地区的种植。近期研究进展已鉴定出关键耐冷基因、解析了自然变异、阐明了信号通路并实现了多组学网络构建。部分研究为ZmICE1与氨基酸代谢及COR基因表达的偶联、COOL1启动子变异与HY5结合及高纬度适应性的关联、以及HSF21参与脂质稳态且无明显产量损失提供了证据。若干新基因（ZmWAK3、ZmMAPK4、TIP4;3、ZmDUF966-10）已被鉴定为有前景的候选基因，拓展了用于进一步验证的遗传资源库。在机制层面，非常规的ZmBSK4-ZmMAPK4级联、钙-MAPK（mitogen-activated protein kinase）交叉对话、组蛋白修饰和小RNA介导的调控已被认为参与冷响应，尽管各机制经实验验证的程度不一。整合性方法（染色质可及性、WGCNA（weighted gene co-expression network analysis）、多组学）揭示了转录因子、表观遗传、激素和代谢之间的层级协同作用。优良等位基因（COOL1HapA、HSF21Hap1和TIP4;3有益单倍型）代表了分子设计的潜在靶标，而CRISPR/Cas9为加速基因编辑和聚合提供了机会。本综述综合了上述进展，并为玉米耐冷育种提供了综合框架。
1. 引言
1.1. 玉米低温胁迫的严重性与紧迫性
玉米（*Zea mays* L.）是全球最重要的作物之一，是食品、饲料和工业原料的主要来源。其持续高产对全球粮食安全和可持续农业发展至关重要。2026年，联合国粮食及农业组织预测全球玉米收获量达13亿吨，生产跨越从热带到温带纬度的多样农业生态区。作为起源于热带和亚热带生境的喜温作物，玉米对低温胁迫具有固有的低耐受性。低温胁迫在整个生命周期中对玉米生长发育产生不利影响。例如，低温胁迫（约5 °C）显著抑制不同育种形式玉米幼苗的萌发、生长和存活，并增加膜透性，膜透性可作为评价耐冷性的可靠生理指标。当温度降至10 °C以下时，玉米幼苗生长明显减缓，在6–8 °C时完全停止。此外，耐冷性与蔗糖/淀粉代谢的高效调控密切相关，耐冷品系在14 °C白天/10 °C夜间条件下长期低温胁迫中维持较高的叶绿素含量、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性和蔗糖/淀粉比值。低温条件破坏玉米的生理生化代谢，抑制种子萌发、幼苗建成、光合效率和生殖发育，严重冷害导致植株死亡和大幅产量损失。然而，玉米对冷驯化的分子和代谢机制仍知之甚少，尤其是核心调控组分之间的协调。因此，阐明这些机制是开发耐冷种质和提高谷物产量的先决条件。
玉米冷害通常由0–15 °C范围内的持续低温引起。从生理学角度，低温损伤通过四种主要机制发挥作用：（i）膜流动性降低，伴随膜脂相变和透性升高；（ii）光合和呼吸活性受抑制，导致能量稳态扰动；（iii）活性氧（reactive oxygen species, ROS）过量产生及随之而来的氧化损伤；（iv）蛋白质生物合成受抑制并诱导蛋白质变性。
在全球气候变化背景下，极端温度事件（例如晚春霜冻）的频率在中国东北和其他高纬度玉米种植区显著增加。同时，玉米种植向高纬度寒冷地区的逐步北移（或南移）扩张加剧了对耐冷品种的迫切需求。然而，传统育种方法受耐冷性多基因架构以及抗冷性与早熟、高产等关键农艺性状之间遗传权衡的制约。此外，表型选择准确性易受环境变异影响，传统耐冷性评价通常需要破坏性取样，阻碍了早期世代的大规模筛选。因此，解析支撑耐冷性的分子调控网络、 pinpoint关键基因和优良等位变异，并基于这些遗传资源实施分子设计育种策略，已成为克服传统育种过程固有局限性的迫切任务。
1.2. 植物低温响应研究背景
植物对低温胁迫的响应是一个多层复杂的协同调控过程，涵盖冷信号感知与转导、转录重编程、代谢重塑和表观遗传调控。在拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）中，低温响应的分子基础已被广泛阐明：冷信号最初由质膜定位的钙通道和受体激酶感知，触发胞质Ca
2+浓度快速升高。该钙瞬变随后激活钙依赖性蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases, CPKs）和MAPK级联。经逐步信号放大后，这些通路汇聚于核心ICE1–CBF–COR转录调控模块，进而诱导冷响应基因广泛表达并增强植物冷驯化能力。
然而，作为C4作物，玉米在低温响应机制上与C3模式植物拟南芥存在深刻差异。首先，C4光合途径本质上对低温更为脆弱，关键C4酶活性在冷害条件下下降更为剧烈。其次，玉米驯化历史相对较短，主要局限于温暖地区，导致耐冷相关基因的自然变异有限。第三，玉米基因组大且具有广泛的基因重复和功能分化，许多冷响应基因家族经历了显著扩张。因此，在拟南芥中建立的知识框架不能直接转移来解释玉米特有的冷响应特征，凸显了针对该作物进行系统研究的迫切需求。
玉米耐冷性受复杂的遗传架构调控。尽管低温暴露触发数百个基因的差异表达，但仅有限的主效位点和核心调控枢纽最终决定了不同种质间观察到的耐冷性自然变异。近年来，全基因组关联分析（genome-wide association study, GWAS）、图位克隆、转录组测序分析和基于基因编辑的功能验证的整合已成为挖掘玉米耐冷基因的强大技术体系。通过这些多组学和遗传验证方法，一系列具有实际育种价值的耐冷关键基因已被成功鉴定和功能表征。这些候选基因涵盖多种功能类别，包括转录因子、蛋白激酶、水通道蛋白以及具有独特结构域的功能未表征蛋白。
尽管此前已有若干综述涉及玉米耐冷性的生理、遗传和育种方面，但大多数发表于近期功能验证基因和自然变异浪潮之前，很少有研究将新鉴定的模块、表观遗传调控和多组学发现系统整合为连贯的调控框架。特别是，早期综述未能充分涵盖：（i）近期鉴定和功能验证的耐冷基因，如ZmICE1、COOL1、HSF21、ZmWAK3、TIP4;3和ZmDUF966-10，重点在于其分子机制而非描述性编目；（ii）耐冷适应的自然变异基础，包括优良单倍型及其进化和驯化历史；（iii）信号网络的整合视图，涵盖非典型ZmBSK4–ZmMAPK4级联、钙信号、表观遗传和小RNA调控以及激素交叉对话；（iv）育种应用，包括分子标记、基因聚合、基因组选择和分子验证与品种开发之间的实际差距。本综述以“关键基因发现—信号通路解析—遗传改良应用”为主线，系统综合近年来玉米耐冷分子研究的标志性进展。研究人员重点介绍核心耐冷基因的鉴定及其自然等位变异的表征，总结低温信号转导和调控网络的当前进展，并评估抗冷遗传改良策略。此外，批判性分析现有瓶颈并展望未来研究方向。通过这一综合，旨在为耐冷玉米的基础研究和分子育种提供理论见解和实践指导。
2. 关键基因挖掘与自然变异解析
2.1. ZmICE1：偶联转录调控与氨基酸代谢的双功能调控因子
ICE1（INDUCER OF CBF EXPRESSION 1）作为进化上保守的ICE–CBF–COR冷信号级联中的上游转录因子，其直系同源物广泛存在于包括拟南芥、水稻和玉米在内的多种植物中。拟南芥早期研究确立ICE1在低温条件下特异性激活CBF基因转录。随后的机制研究完善了该通路的调控模型：在常温下，ICE1受HOS1介导的泛素化及随后的蛋白酶体降解；然而冷暴露通过SUMO化稳定该蛋白，从而维持下游冷响应基因表达。与拟南芥中观察到的以翻译后修饰为中心的调控不同，玉米ZmICE1表现出显著的物种特异性特征，受转录和翻译后双重控制。这种分化双重调控是否与玉米C4光合系统的独特代谢适应性相关仍是一个有待进一步研究的开放性问题。
为阐明这一开放性问题，研究人员系统解析了ZmICE1的功能特性，揭示了其在玉米冷响应过程中独特的双重转录作用。在低温下，ZmICE1直接结合并反式激活ZmDREB1（CBF的玉米直系同源物），从而启动经典COR依赖性冷响应转录程序并正向调控耐冷性。同时，ZmICE1抑制天冬酰胺合成酶基因家族（ZmASs）的转录，从而在冷胁迫下维持氨基酸代谢稳态。这些发现确立玉米ZmICE1作为具有激活和抑制能力的双功能转录因子——这种作用模式扩展了此前认识的植物ICE1蛋白调控库。
天冬酰胺在谷氨酸/天冬酰胺代谢途径中占据关键地位。代谢组学分析揭示冷诱导的ZmASs上调导致谷氨酸和天冬酰胺大量积累，进而引发线粒体活性氧（mitochondrial ROS, mtROS）爆发。过量mtROS进一步抑制ZmDREB1的冷诱导表达。生化证据表明，过量氨基酸进入线粒体通过脱氢酶产生还原当量，促进电子传递链泄漏和随后的ROS产生。ZmICE1直接靶向ZmASs的启动子区域并抑制其转录，从而阻断过量谷氨酸/天冬酰胺触发的mtROS过度积累，为高效的ZmDREB1转录建立有利的细胞内氧化还原环境。这一涵盖转录因子、代谢酶和ROS的调控回路强调了氨基酸代谢稳态在玉米冷驯化中的核心重要性。
ZmICE1启动子的自然等位变异是玉米自交系间耐冷性差异的主要遗传决定因素。对245个自交系进行的GWAS鉴定出ZmICE1启动子中的SNP ?465为关键功能变异，具有两种等位形式（A和C）。携带A等位基因的耐冷单倍型产生被ZmMYB39识别的顺式元件，促进其结合；冷敏感C等位基因削弱这一相互作用。ZmMYB39与A型启动子的结合提升ZmICE1转录并维持较高的ZmICE1蛋白丰度。由此产生的ZmICE1增加同时激活ZmDREB1以启动经典冷信号级联并抑制ZmASs以减轻mtROS爆发，从而通过双重调控输出协同增强耐冷性。转基因互补试验证明ZmICE1过表达显著提高冷胁迫下幼苗存活率并减轻膜损伤。总之，这项工作不仅完善了玉米ZmICE1的调控框架，还验证了ZmICE1启动子功能变异作为分子标记的实用性，为耐冷玉米种质的标记辅助选择提供了切实靶标。
2.2. COOL1：控制高纬度冷适应的遗传开关
2.2.1. GWAS鉴定与单倍型分析
与调控玉米耐冷性内部分子通路的ZmICE1互补，COOL1是一个新鉴定的基因，揭示了玉米适应北方高纬度寒冷生境的进化和驯化基础。利用涵盖热带、亚热带、温带和冷温带种质的205个玉米自交系多样性群体，全基因组关联分析成功定位了COOL1（COLD-RESPONSIVE OPERATION LOCUS 1）。该基因位于3号染色体短臂，编码参与冷响应调控的碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix, bHLH）转录因子。其耐冷等位基因COOL1
HapA在美国地方品种中频率达88%，并随纬度升高急剧上升，在美国近乎固定。此前研究已证明COOL1代表耐冷玉米分子设计育种的高度有前景的靶标。
低温胁迫显著抑制COOL1的转录水平，且这种抑制幅度与不同玉米基因型的耐冷性密切相关。功能表征验证COOL1作为玉米耐冷性的负调控因子。COOL1转录本积累较高使玉米植株更易受冷害。相反，通过EMS诱变或CRISPR/Cas9编辑产生的COOL1功能缺失突变体在4 °C下相对于野生型对照表现出显著改善的幼苗存活率。
COOL1启动子区域的九个单核苷酸多态性将自然玉米群体分为两个主要单倍型，即HapA和HapB。群体单倍型分析显示HapA种质主要分布于高纬度寒冷地区，包括东北地区。
2.2.2. HY5介导的光信号整合
然而，近期研究表明COOL1整合光和钙信号以精细调控玉米耐冷性。分子解析进一步揭示COOL1启动子的自然序列多态性调节光信号核心转录因子HY5（ELONGATED HYPOCOTYL 5）对A-box顺式元件的结合亲和力。HY5与COOL1启动子A-box区域的物理相互作用通过电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）和染色质免疫沉淀结合定量PCR（ChIP-qPCR）得到证实。值得注意的是，HapA启动子特征的核苷酸组合重塑了A-box周围的序列背景，大幅增强HY5结合。
在高纬度地区，春季日照时长在低温条件下逐渐增加，光信号激活HY5，导致蛋白丰度和活性升高。增强的HY5与HapA启动子结合在低温胁迫下抑制COOL1转录，从而减轻其对下游靶标的抑制作用，确保ZmDREB1和ZmTPS（trehalose-6-phosphate synthase）的正常冷诱导表达。该级联最终导致耐冷性提高。相反，HapB品系中较弱的HY5–启动子相互作用无法在冷暴露期间充分抑制COOL1转录。随之而来的COOL1蛋白积累干扰ZmDREB1诱导，使HapB自交系更易受冷害。
其他工作涉及钙依赖性蛋白激酶CPK17在调控COOL1活性中的层级作用。冷刺激后，CPK17转位至细胞核并磷酸化COOL1，阻碍其被26S蛋白酶体降解从而稳定该蛋白。这一钙信号模块与HY5介导的光信号通路协同作用，构成多层调控网络，整合多种输入以决定玉米冷响应程序的整体幅度。
2.2.3. 从类蜀黍到现代玉米的适应性进化
进化分析已将COOL1
HapA单倍型的起源追溯至类蜀黍（玉米的野生祖先），而非现代育种工作。通过对类蜀黍、墨西哥草和数千份前哥伦布时期玉米地方品种进行基因分型，研究人员重建了COOL1等位变异的进化历史。尽管HapA等位基因在野生类蜀黍群体中频率较低，但随着种植向高纬度地区扩张，它受到正选择并在温带和冷温带玉米种质中逐步积累——这是其在冷害条件下适应性优势驱动的结果。
COOL1的发现代表多个方面的里程碑：它不仅提供了具有直接应用于玉米育种价值的优良耐冷等位基因（HapA），还提供了首个整合光和冷信号以调控高纬度环境适应的分子框架。此外，基于COOL1启动子关键多态性位点开发的功能分子标记为高效筛选耐冷玉米种质提供了实用工具。
2.3. HSF21：脂质代谢稳态与耐冷性之间的新纽带
2.3.1. 从热到冷胁迫响应的功能拓展
热激转录因子（heat shock transcription factors, HSFs）长期被认为是热胁迫响应的主要调控因子，通过调节热激蛋白（heat shock proteins, HSPs）维持细胞蛋白稳态。累积研究证实HSF家族广泛参与多种非生物胁迫响应，成为植物胁迫信号网络的中心整合者。大多数B类HSF在热响应通路中作为转录抑制因子。然而，近期研究揭示B类转录因子HSF21（HEAT SHOCK TRANSCRIPTION FACTOR 21）作为玉米耐冷性的关键正调控因子。这一发现拓展了HSF家族的功能谱，暗示热和冷响应通路之间部分调控模块的进化共享，并为解析温度交叉胁迫调控网络提供了新线索。
2.3.2. bZIP68–HSF21调控模块
在多样自然玉米群体中进行的GWAS发现了优良耐冷等位变异HSF21
Hap1，其启动子携带?683 bp SNP和?693 bp 5-bp InDel。这些多态性改变了bZIP68识别的A-box顺式元件序列，导致启动子转录活性显著增加。分子互作试验进一步确立HSF21表达在冷敏感自交系中受bZIP68转录抑制，EMSA和ChIP-qPCR证实bZIP68直接结合HSF21启动子的A-box区域。
值得注意的是，定义HSF21
Hap1启动子的关键序列变异落在核心bZIP68结合结构域内，从而削弱物理相互作用并解除对HSF21的转录抑制。在低温条件下，HSF21高效冷诱导发生，产生的核定位HSF21蛋白直接激活核心脂质代谢基因的转录，包括GPATs、SADs和FADs。细胞膜中不饱和脂肪酸的组成关键决定低温下的膜流动性，代表植物抗冷性的基本生理决定因素。通过协调脂质代谢重编程，HSF21在低温胁迫下维持膜脂稳态，从而增强玉米耐冷性。
2.3.3. 协调耐冷性与高产的分子基础
作物胁迫育种中一个长期存在的普遍挑战是胁迫耐受性与农艺表现之间的遗传权衡：大多数胁迫响应基因的组成型过表达往往 penalizes 营养生长并降低谷物产量。然而，转基因品系的田间试验表明，HSF21过表达不仅显著提高幼苗耐冷性，还在最适温度条件下增加谷物产量，未观察到产量损失。脂质组学分析证实HSF21上调不饱和脂肪酸生物合成途径并有助于在低温胁迫下稳定膜结构。
这些发现表明抗逆性与产量之间的拮抗并非不可克服；相反，精确调控脂质代谢稳态可以协调耐冷性与产量形成。作为罕见的在有利条件下兼具增强耐冷性和产量稳定性的自然等位变异，HSF21
Hap1为打破胁迫韧性与生产力之间的权衡提供了宝贵遗传资源。它也代表有前景的候选基因和可直接使用的种质资源，用于旨在开发耐冷玉米品种的分子设计育种。
2.4. ZmWAK3：壁关联激酶介导的胁迫响应潜在调控位点
2.4.1. ZmWAK3的基因特征与胁迫响应线索
壁关联激酶（wall-associated kinases, WAKs）是植物特有的受体样激酶，定位于细胞壁-质膜界面。它们感知细胞壁结构完整性变化并触发细胞内信号级联，作为连接细胞外环境刺激与细胞内胁迫适应响应的关键分子枢纽，在多种植物非生物胁迫适应中发挥重要作用。在玉米中，WAK家族成员广泛参与包括干旱、盐度和温度波动在内的多种非生物胁迫下的转录重编程，代表了解析玉米胁迫感知机制的有前景的候选基因家族。
ZmWAK3是玉米WAK家族的典型成员，编码包含胞外WAK结构域、跨膜结构域和胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域的完整膜结合受体蛋白，具备WAK家族蛋白胞外信号感知、跨膜信号转导和胞内磷酸化激活的保守结构基础。此前研究已验证ZmWAK3在干旱胁迫下的明确生物学功能：它作为玉米苗期耐旱性的负调控因子，通过调节细胞壁果胶代谢和气孔动态介导干旱响应。
玉米WAK家族的全基因组转录组分析表明ZmWAK3表达受温度胁迫调控并表现出明显的组织特异性表达偏好。这些观察暗示除干旱适应外，ZmWAK3还可能参与冷胁迫信号感知。进一步研究证明来自过表达品系和功能缺失突变体的遗传证据证实ZmWAK3直接调控玉米耐冷性，其在玉米冷响应通路中的确切生物学作用已进一步经遗传验证。
2.4.2. ZmNAC100-ZmWAK3转录调控模块
转录解析鉴定NAC家族转录因子ZmNAC100作为驱动ZmWAK3冷诱导表达的核心上游激活因子。包括酵母单杂交、双荧光素酶报告和ChIP-qPCR在内的多种分子互作试验验证了ZmNAC100与ZmWAK3启动子中顺式元件的特异性结合以直接激活其冷触发转录。ZmNAC100本身受低温强烈诱导；过表达品系显示增强的耐冷性而基因沉默品系显示与ZmWAK3突变体高度一致的冷敏感表型，确认了紧密的上游-下游转录调控模块。
整合生理和转录组分析进一步揭示该模块通过多种汇聚通路协调玉米冷适应。一方面，它强烈上调关键抗氧化酶基因的表达，包括SOD、POD、CAT和APX，从而增强ROS清除能力并减轻冷暴露触发的氧化损伤和膜损伤。另一方面，它维持光合功能核心基因的表达，保持光合电子传递效率和光合器官结构完整性，从而减轻低温对光合代谢的抑制作用。总之，这些发现描绘了WAK介导的玉米冷响应的机制框架，并建立了一个此前未被认识的冷调控级联——涵盖细胞壁信号感知、转录激活以及抗氧化和光合系统的稳态控制——从而大幅丰富了当前对该作物冷信号感知网络的理解。
2.4.3. ZmWAK3的胁迫特异性功能分化
一个有趣的观察是ZmWAK3根据挑战性质对胁迫响应发挥相反作用：在冷胁迫下作为正调控因子，而在干旱条件下作为负调控因子。在水分亏缺下，ZmWAK3增强多聚半乳糖醛酸酶活性，降低果胶含量、松弛细胞壁并调节气孔开度，最终导致幼苗耐旱性受损。其干旱诱导表达由转录因子ZmWRKY44直接激活。ZmWAK3在不同胁迫间的功能双重性强调了WAK介导信号通路的高度环境特异性。因此，在育种应用中，遗传操作策略必须针对目标胁迫类型量身定制，而非依赖一刀切的方法。
2.5. TIP4;3和ZmDUF966-10：新型调控因子的功能表征
2.5.1. TIP4;3：水通道蛋白的表观遗传调控
水通道蛋白是调节细胞内水分运输、渗透稳态和胁迫适应性的核心膜蛋白，已被广泛认为参与玉米对冷、干旱和其他非生物挑战的响应。其中，由TIP4;3编码的液泡膜定位水通道蛋白已被鉴定为种子萌发和幼苗建成期间耐冷性的关键负调控因子。在低温条件下，TIP4;3转录本丰度在冷敏感自交系中显著高于耐冷自交系，其表达水平与抗冷性负相关。通过CRISPR/Cas9介导的敲除破坏TIP4;3显著提高冷条件下萌发效率和幼苗存活率，确认其在玉米耐冷性中的抑制功能。
自然遗传变异分析揭示TIP4;3启动子内CACTA家族MITE转座子的插入构成玉米群体间耐冷性差异的关键功能多态性。该转座子插入大幅提升启动子区域DNA甲基化水平，导致TIP4;3转录的表观遗传抑制，为自然群体中的耐冷种质提供遗传基础。机制解析进一步揭示TIP4;3负调控冷适应性的两条不同途径。首先，TIP4;3定位于保卫细胞液泡膜，调节液泡水分稳态并影响气孔开度，从而在低温下加速水分损失并加剧冷害。其次，TIP4;3通过调节NADPH氧化酶活性促进过量ROS积累，进而抑制核心DREB家族冷响应基因的冷诱导并阻碍经典ICE–CBF冷级联的激活，最终损害植物冷驯化。总之，这些发现拓宽了对水通道蛋白在玉米冷响应中功能的理解，并将表观遗传调控、ROS稳态和冷信号交叉对话整合为更全面的玉米耐冷多层分子网络框架。
2.5.2. ZmDUF966-10：未知功能结构域家族的新成员
DUF966家族由植物特有蛋白组成，其生物学功能在很大程度上仍未表征，它们在胁迫响应——特别是玉米冷适应——中的参与鲜有报道。全基因组鉴定和序列分析揭示玉米ZmDUF966家族成员的启动子富含冷和脱落酸（abscisic acid, ABA）响应顺式元件，暗示可能通过ABA信号级联参与冷适应。转录谱分析鉴定ZmDUF966-10为响应低温的主要家族成员，在叶片和根系中均观察到稳定的冷诱导上调。转录后调控分析进一步表明ZmDUF966-10被保守microRNA zma-miR159靶向，后者施加负翻译控制并有助于其表达的多层调控。蛋白-蛋白互作试验证实ZmDUF966-10与涉及ABA和渗透胁迫相关信号的调控蛋白之间的物理关联，为其作为ABA级联辅助组分介导玉米冷响应提供初步证据。总之，这项工作为DUF966家族成员在植物冷响应中稀缺的文献增添了新案例，并拓展了对先前未知功能结构域蛋白调控冷机制的理解。
2.6. 其他新鉴定的耐冷基因与自然变异
2.6.1. ZmNTL1和ZmNTL5：双功能NAC转录因子
膜锚定NAC转录因子代表参与植物非生物胁迫响应的主要基因家族，在信号转导和对冷、干旱和盐度的适应中具有已记载的功能。通过冷转录组筛选结合遗传功能验证，鉴定出两个NAC家族调控因子——ZmNTL1和ZmNTL5——作为玉米耐冷性的正调控因子。这两个高度同源的蛋白定位于细胞核并被低温暴露显著上调。ZmNTL1和ZmNTL5功能缺失双突变体在冷害条件下表现出严重受损的存活率，确认它们对冷适应的协同和正向贡献。
转录组富集分析揭示ZmNTL1和ZmNTL5主要调控两条核心冷适应通路——渗透保护剂生物合成和ROS清除——同时也参与细胞壁重塑。相应地，这些转录因子调节关键冷响应靶基因的表达，包括P5CS、TPS、SOD和POD，以及细胞壁相关基因如XTH和EXP。通过促进渗透保护化合物的积累、消除过量ROS和精细调节细胞壁结构稳态，它们协调多维协同冷调控网络。这项工作不仅拓展了膜结合NAC因子在低温响应中的功能库，还为耐冷玉米分子设计育种提供了宝贵遗传资源和调控靶标。
2.6.2. ZmbHLH30：种子萌发期耐冷性的关键调控因子
萌发期低温对春玉米产区的幼苗出土和建成构成主要制约。通过QTL定位结合来自耐冷和冷敏感自交系杂交衍生的重组自交系（recombinant inbred line, RIL）群体的精细筛选，将萌发期耐冷性的主效QTL定位到10号染色体，其 underlying 因果基因被鉴定为ZmbHLH30。功能验证证实ZmbHLH30在萌发、出苗和幼苗阶段作为耐冷性的正调控因子；过表达ZmbHLH30的转基因品系在冷害条件下相比野生型对照表现出显著改善的萌发效率和幼苗生长。
整合多组学分析揭示ZmbHLH30通过协同激活抗氧化防御和渗透调节系统增强抗冷性。具体而言，它强烈上调抗氧化酶基因表达，从而增强ROS清除能力，同时促进脯氨酸、可溶性糖和其他渗透保护化合物的积累以在低温下稳定细胞渗透势和膜完整性，共同减轻冷害。亚细胞定位和异源表达试验进一步指向ZmbHLH30的物种特异性调控特征，为单子叶植物冷调控机制基础提供新见解。
2.6.3. 其他候选基因
除上述核心调控因子外，近期研究揭示了越来越多参与冷响应的新基因和通路，进一步丰富了玉米耐冷性的遗传资源库。其中一个例子是ZmBARK1，一种与油菜素内酯（brassinosteroid, BR）信号相关的激酶，在萌发和早期幼苗发育中负调控耐冷性。ZmBARK1功能缺失突变体在低温条件下表现出显著改善的萌发能力和幼苗存活率，将该基因定位为控制早期发育阶段冷适应的关键负调控因子。
2.7. 小结
总之，本节表征的关键耐冷基因可分为五个功能类别：转录调控因子（ZmICE1、COOL1、HSF21、ZmNAC100、ZmNTL1/5和ZmbHLH30）；膜传感器和信号转导因子（ZmWAK3）；代谢稳态调节因子（ZmICE1和HSF21）；渗透和水分平衡控制器（TIP4;3）；以及具有尚未表征结构域的蛋白（ZmDUF966-10）。总之，这些组分形成控制玉米冷响应程序的多层调控网络，不同通路间存在广泛交叉对话。ROS稳态作为连接代谢和转录输出的枢纽；光和冷信号通过COOL1汇聚；多个级联协同作用塑造整体耐冷表型。这一不断增长的功能验证基因库为旨在增强玉米抗冷性的分子设计育种提供了丰富精确定义的靶标资源库。
这些候选基因均被认为参与耐冷性，但支持它们的证据在质量和类型上不均衡。ZmICE1、COOL1、HSF21和TIP4;3得到GWAS或群体水平自然变异证据的支持，而ZmWAK3、ZmNTL1/5、ZmbHLH30和ZmBARK1主要基于QTL定位或反向遗传学方法，尚未在群体尺度验证。大多数以转录因子为中心的模块已在生化水平验证蛋白–DNA或蛋白–蛋白相互作用，但若干膜定位或未表征结构域蛋白仍缺乏可比证据。在所有候选基因中，仅HSF21接受了有限的田间产量表现评估，而大多数表型验证仍局限于受控环境的幼苗或萌发试验。因此，将实验室衍生的机制发现直接外推到田间育种应用时需谨慎。尽管如此，这一不断扩展的功能验证基因集构成了宝贵资源，为旨在增强玉米抗冷性的分子设计育种提供了明确定义的靶标。
3. 控制玉米冷响应的多层分子调控网络
3.1. 非典型MAPK级联：ZmBSK4–ZmMAPK4–ZmbHLH111/181
3.1.1. 经典三层MAPK级联的内在局限性
经典MAPK信号级联通过三层磷酸化 relay——MAPKKK→MAPKK→MAPK——运作，通过顺序磷酸化事件放大胁迫信号。尽管这种逐步架构非常适合信号放大和特异性，但其多步性质可能限制信号传递速度，潜在地制约植物对突发冷事件（如晚春霜冻）的快速响应能力。在玉米中，鉴定出九个MAPKK编码基因，随后的基因组注释未大幅扩展该基因家族。上游激酶这一相对有限的库可能无法完全容纳低温胁迫触发的多样和特异性输入。这些考虑导致假设玉米可能拥有额外的非典型MAPK激活途径，绕过传统的MAPKK依赖中间步骤，从而提供与经典MAPK级联并行（而非必然替代）运作的额外快速信号机制。
3.1.2. 直接ZmBSK4介导的ZmMAPK4激活的分子机制
一个不依赖MAPKK的MAPK激活级联，从而扩展了这些激酶在植物冷响应中已知的调控库。在冷害条件下，油菜素内酯信号激酶ZmBSK4直接与ZmMAPK4结合并在Ser-171位点特异性磷酸化。重要的是，该单一残基的磷酸化足以完全激活ZmMAPK4激酶活性，绕过MAPKK介导磷酸化的需求。体外激酶试验证明纯化的ZmBSK4对ZmMAPK4的催化效率与经典MAPKK激酶相当。冷胁迫下的时程实验揭示ZmMAPK4磷酸化在早期时间点快速发生，响应动力学显著快于传统三层级联。这种快速激活为玉米及时防御突发冷害提供分子基础。
3.1.3. ZmbHLH111/181介导的下游冷响应基因转录激活
激活后，ZmMAPK4直接磷酸化两个下游bHLH转录因子ZmbHLH111和ZmbHLH181。质谱结合体外磷酸化试验鉴定修饰残基：ZmbHLH111中的Thr-42和Ser-48，以及ZmbHLH181中的Thr-38和Ser-44。这些位点的磷酸化显著促进两因子的核转位。进入细胞核后，它们特异性结合冷响应基因启动子中的E-box（CANNTG）顺式元件，从而诱导核心耐冷基因表达，包括ZmDREB1.2、ZmDREB1.4、ZmDREB1.9、ZmDREB1.10、SOD和POD。该转录输出协同增强幼苗冷适应。该通路的正调控作用通过使用转基因材料的一系列室内冷表型试验得到佐证：ZmBSK4和ZmMAPK4过表达品系表现出减轻的冷损伤和改善的幼苗存活率，而ZmbHLH111敲除突变体显示加重冷害。此外，已知经典MAPKK也参与玉米冷响应，其功能框架为该非典型级联提供有用的比较背景。
3.2. 冷响应中的钙信号：保守模块、玉米特异性分支和MAPK交叉对话
钙依赖性蛋白激酶（CDPKs）的独特之处在于将Ca
2+结合和激酶催化结构域整合于单一多肽中，使其成为将钙信号转化为转录输出的中心枢纽。在拟南芥中，冷激活的CPK28磷酸化NLP7，促进其核转位和随后激活CBF/COR转录，从而影响耐冷性。玉米基因组含有同源CPK28和NLP7序列，暗示潜在保守性，但缺乏玉米中的直接活体证据。因此该模块应被视为拟南芥衍生的候选通路而非已验证的玉米冷调控机制。
与该保守候选模块不同，一个玉米特异性钙调控分支已被功能解析。冷触发的钙信号激活CPK17激酶并触发其向细胞核转位。进入后，活化的CPK17与COOL1物理关联并在Thr-124位点磷酸化（经LC-MS/MS鉴定）；该位点替换显著减弱CPK17介导的磷酸化。该磷酸化事件降低26S蛋白酶体对COOL1的识别和随后降解，从而提高COOL1蛋白积累。鉴于COOL1作为耐冷性的负转录调控因子，其丰度增加抑制核心抗冷基因（包括ZmDREB1和ZmTPS）的转录，最终损害冷适应。该调控回路例证钙信号如何通过稳定负调控因子微调冷响应强度，从而建立玉米特异性钙信号平衡级联。
除这些钙感知模块外，钙信号并非孤立运作；相反，它与非典型ZmBSK4–MAPK级联和经典三层MAPK级联在多个层面进行广泛交叉对话。在拟南芥等模式系统中，钙信号常作为上游开关调节MAPKKK–MAPKK–MAPK激酶层级的活性。这种钙–MAPK交叉对话在玉米中是否以相同方式运作尚不清楚，玉米中这些层互连的直接证据仍然有限。钙感知、MAPK介导信号放大和bHLH依赖转录调控的互连层已被提出构成玉米完整的冷信号转导网络，但需要进一步活体验证以确认该框架。
3.3. 核心冷响应基因集和共表达网络的系统鉴定
3.3.1. 多种胁迫共享核心基因概述
玉米在应对冷、干旱、盐度和其他非生物胁迫时部署一套共享核心胁迫响应基因。多胁迫转录组数据集的整合分析已 pinpoint AP2/ERF、NAC、bZIP、HSF和C2C2-CO-like家族作为协调胁迫调控的主要转录因子群。作为上游信号开关运作，这些转录因子驱动下游功能基因的广泛表达，通常表现出比其靶基因更大的表达波动——与转录水平信号放大一致的模式。
从冷调控级联角度，玉米冷响应基因可分为两大类：通过CBF依赖通路运作的和独立于CBF运作的。CBF/DREB1级联构成核心冷驯化分支，而NAC和bHLH转录因子介导的补充途径也贡献于冷转录重编程。两类通路的协调作用确保玉米成功冷适应——这一分层调控架构已在包括拟南芥和玉米在内的跨物种中得到验证。
3.3.2. “核心–卫星”层级共表达网络模型
来自冷胁迫玉米转录组数据集的加权基因共表达网络分析（WGCNA）一致揭示“核心–卫星”拓扑架构。在该框架中，核心转录因子与广泛胁迫响应基因建立强共表达连接，而与胁迫特异性卫星基因仅维持弱连接，共同产生多层调控网络。核心枢纽——包括ZmERF、ZmNAC和ZmbZIP——整合多样环境信号，而卫星基因执行针对特定胁迫的生理功能。这种网络拓扑赋予一定程度的环境挑战缓冲能力；核心节点的功能冗余和多重性确保基础水平的胁迫耐受性，从而为多基因抗性性状提供关键遗传基础。
3.3.3. 玉米冷响应的发育阶段特异性
玉米在不同发育阶段对低温部署不同的调控策略。在种子萌发期间，胁迫响应基因显著富集于ABA和赤霉素（gibberellin, GA）激素代谢以及细胞壁重塑相关通路。相反，幼苗主要激活控制抗氧化酶（包括SOD、POD和CAT）的级联，以及脯氨酸、海藻糖和其他渗透保护代谢物的积累。
这种阶段特异性转录分歧决定了育种改良的不同优先事项。增强萌发期耐冷性主要集中于ZmICE1介导的氨基酸代谢级联，而改善幼苗抗冷性则聚焦于COOL1光–温度模块和非典型ZmBSK4–ZmMAPK激酶级联。在一项相关研究中，评估了苗期冷害表型并进行GWAS以鉴定与苗期耐冷性相关的多个候选基因和分子标记，从而为分子育种提供宝贵资源。这些候选基因包括编码MYB和GRAS转录因子、富含亮氨酸重复（leucine-rich repeat, LRR）蛋白和蛋白激酶的基因。
3.3.4. 通过WGCNA挖掘调控枢纽基因
利用耐冷和冷敏感自交系在萌发和幼苗阶段的转录组谱构建低温胁迫下的加权基因共表达网络。模块-性状关联分析揭示富集于激素信号、氧化还原稳态和MAPK通路的模块与耐冷表型呈强正相关。相反，与细胞壁合成和泛素介导蛋白降解相关的模块与抗冷性呈负相关。值得注意的是，以ZmICE1为中心的共表达模块包含多个激酶和转录因子枢纽，包括ZmMAPK、ZmWRKY和ZmERF，暗示它们协同参与玉米冷响应网络。
3.4. 冷响应的表观遗传和染色质水平调控
3.4.1. 冷诱导的染色质可及性重塑
染色质可及性的动态重塑是冷胁迫下转录重编程的关键表观遗传机制。拟南芥和水稻等模式物种的广泛研究已确立低温诱导DNase I超敏感位点（DNase I-hypersensitive sites, DHSs）和可及染色质区域（accessible chromatin regions, ACRs）的全基因组重排。然而在玉米中，尽管已有少量ATAC-seq和DNase-seq数据集，基因组尺度上染色质可及性的时间序列和组织特异性变化的系统分析仍然有限。值得注意的是，植物中很大比例的DHSs位于基因间非编码区，暗示远端顺式调控元件参与冷信号感知，并指向玉米冷响应表观遗传调控的未探索途径。组蛋白乙酰化也广泛参与植物冷响应；乙酰化状态的变化影响染色质构型并调节冷响应基因转录。然而，玉米中控制这些乙酰化动态的调控模式有待彻底实验验证。
3.4.2. 冷重塑可及染色质中转录因子结合的基序特征
在低温下转变为可及状态的染色质区域通常富含多种转录因子识别的顺式结合基序，这些基序介导胁迫信号的转录输出。ERF、NAC和bZIP家族的基序在冷响应ACRs中经常过度代表。多个转录因子常同时结合单个开放染色质位点，使协同调控模块的形成成为可能，整合来自上游级联的信号以协调下游冷响应基因表达。其中，CBF/DREB、NAC和bZIP家族被认为是植物冷响应的核心调控因子——这一功能范式已通过整合多物种转录组分析得到验证。
3.4.3. 组蛋白修饰的动态重编程
激活型组蛋白标记H3K4me3和抑制型标记H3K27me3在植物冷适应过程中经历基因组尺度的动态重编程，它们的双价构型共同塑造与胁迫韧性相关的转录调控网络。在拟南芥中，ChIP-seq数据揭示冷暴露快速且特异性改变冷调控位点H3K4me3和H3K27me3的丰度。在正常条件下，冷响应基因通常被H3K27me3标记；然而，去除该抑制性修饰并非冷诱导转录激活的必需前提。相反，低温同时触发核小体耗竭和双价组蛋白标记的再沉积，通过重塑染色质可及性启动冷转录程序。
在玉米中，冷响应同样依赖染色质开放性和组蛋白修饰的协调作用。此外，已知激素平衡和糖代谢稳态参与冷生理适应。然而，将这些生理级联与染色质重塑和组蛋白修饰事件连接的上游–下游调控联系仍有待整合为统一框架。此外，持续的冷诱导组蛋白修饰重编程可能有助于植物对反复低温环境的适应调控。
3.4.4. 冷共表达网络中的表观遗传调控枢纽基因
由玉米低温胁迫下萌发和幼苗阶段转录组数据构建的加权基因共表达网络可划分为与耐冷表型正相关或负相关的模块。正相关模块富集于ABA和茉莉酸（jasmonic acid, JA）信号、氧化还原稳态和MAPK级联相关基因。相反，负相关模块主要由细胞壁合成和泛素介导蛋白降解相关通路组成。通过模块连通性筛选鉴定的枢纽基因——包括ZmMAPK3、ZmPP2C、ZmHSP90、ZmWRKY24、ZmbZIP23、ZmNAC72和ZmERF7——其耐冷性作用已通过病毒诱导基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS）试验验证。
3.5. 小RNA介导的转录后调控
3.5.1. miRNA在冷响应中的作用
除蛋白编码基因和表观遗传调控外，小RNA在玉米冷调控网络内执行关键的转录后精细调节。跨物种研究已确立miR169靶向NF-YA和miR393靶向TIR1，介导靶向mRNA降解以精确调节冷响应强度。
冷胁迫玉米幼苗的高通量小RNA测序揭示若干miRNA家族的差异冷诱导表达，包括miR156、miR159、miR164、miR167、miR169、miR172、miR319和miR396。其预测靶基因主要富集于生长素、GA和ABA信号级联、NAC/MYB/SBP转录调控通路以及SOD和POD介导的ROS清除级联。
miR164–NAC调控模块在小麦和拟南芥中似乎功能保守。在冬小麦中，低温下调tae-miR164表达同时上调其靶基因TaNAC6A。拟南芥异源转化试验证明tae-miR164过表达减弱耐冷性，而沉默miR164或过表达TaNAC6A增强抗氧化酶活性、降低ROS和MDA积累并激活冷响应级联基因包括AtDREB1、AtDREB2和AtABI5。该模块因此通过CBF依赖和CBF非依赖通路调节冷响应。
然而在玉米中，当前证据仅限于记录zma-miR164冷响应表达变化的测序数据集——其因种质和处理条件而异——以及其与NAC靶标调控关系和耐冷性生物学功能的遗传验证仍然缺失。一篇综合综述强调miRNA与激素信号级联之间的广泛交叉对话，它们通过信号和激素交叉对话共同协调控制作物冷响应的多层分子网络，具有转化意义。
3.5.2. miR159-ZmDUF966-10调控模块
玉米DUF966基因家族的全基因组分析鉴定出zma-miR159在ZmDUF966-10（该家族核心冷响应成员）3′非翻译区（3′UTR）内的保守互补结合位点。生物信息学预测支持两分子之间的靶向相互作用，暗示miR159在转录后水平抑制ZmDUF966-10表达——可能通过mRNA切割或翻译抑制。
在水稻和小麦中，长非编码RNA（long non-coding RNAs, lncRNAs）已被证明作为miRNA海绵竞争性隔离小RNA，从而参与冷胁迫下的转录后调控。然而，玉米冷响应中非编码RNA功能的研究仍然有限。编码基因、miRNA和lncRNA之间的多层协同相互作用共同构成支撑玉米耐冷性的精密分子调控系统。
3.6. 激素信号通路的交叉对话与整合
3.6.1. 激素网络的整体特征
植物激素在冷响应中同时充当“开关”和“放大器”。植物通过多种激素信号之间的交叉对话协调其低温适应，包括ABA、JA、BR、水杨酸（salicylic acid, SA）、GA和乙烯（ethylene, ET）。其中，ABA、JA、BR和SA通常被视为经典胁迫响应激素，其级联在不利条件下被激活。GA主要调控生长过程且在低温下通常被抑制，而乙烯对冷调控发挥双向效应，取决于环境条件和作物基因型。
3.6.2. ABA信号通路
冷诱导的ABA积累通过激活下游转录因子（AREB/ABF、NAC、bZIP）和抗氧化防御系统增强玉米耐冷性。外源ABA施用显著提高冷胁迫玉米幼苗的抗氧化酶活性和渗透保护剂积累，从而减轻膜脂过氧化损伤。此外，ABA信号与MAPK级联进行广泛交叉对话：MAPK通路抑制PP2C磷酸酶（ABA信号的核心负调控因子）活性，从而放大ABA信号输出强度。
3.6.3. BR信号通路
除前述非典型ZmBSK4–ZmMAPK4信号模块外，外源施用24-表油菜素内酯（24-epibrassinolide, EBR）通过调节糖信号和碳代谢增强玉米幼苗耐冷性。EBR上调蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase, SPS）和蔗糖合酶（sucrose synthase, SS）活性，促进蔗糖合成和转运同时抑制蔗糖分解，最终增加植物组织可溶性糖积累。
比较试验检验了外源ABA、外源BR和ABA+BR联合处理对玉米幼苗耐冷性的表型效应。虽然单独施用ABA或BR均有效改善抗冷性，但联合处理未能产生协同效益；事实上，复合施用在脯氨酸积累和SOD活性等指标方面表现劣于单激素处理。转录组数据显示ABA和BR共调控富集于细胞壁和次生代谢通路的基因，而它们独特调控的基因参与不同信号转导过程。这些观察暗示ABA和BR级联在冷信号整合期间存在竞争性交叉对话，或在PP2C和SnRK2等下游靶蛋白差异调控中相互干扰，从而消除协同表型结果。从谷类作物冷适应研究的更广阔视角看，激素交叉对话构成核心前沿，ABA–BR信号相互作用在玉米冷调控系统中占据中心位置。玉米幼苗内源可溶性糖谱与耐冷性水平强相关，最佳浓度外源EBR重塑糖信号和碳代谢稳态以减轻冷诱导损伤。
3.6.4. JA信号通路的最新进展
近期工作鉴定E3泛素连接酶NLA作为低温下JA信号的关键激活因子，通过蛋白酶体降解JAZ11（JA级联的核心抑制因子）发挥作用。JA信号的激活重塑下游转录和代谢网络以介导玉米冷适应。JA级联与CBF依赖和CBF非依赖通路之间存在复杂的相互交叉对话：JA信号正向促进CBF基因转录，而CBF级联反过来调节JA生物合成，共同构建控制冷响应的激素调控网络。CDPKs作为钙信号级联的中心组分，充当互连调节玉米适应多种非生物胁迫的多通路的汇聚枢纽。一篇系统综述解析了CDPKs整合不同信号级联以调控玉米胁迫适应性的分子机制。除CDPKs外，其他信号模块也发挥关键作用。总之，这些通路——从经典三层MAPK级联和非典型ZmBSK4-ZmMAPK4模块到钙信号、核心ZmICE1-ZmDREB1级联和激素网络——形成控制玉米冷响应的多层调控系统。
3.7. 整合多组学分析进展
3.7.1. 转录组-代谢组整合策略
近年来，转录组学、代谢组学和蛋白质组学的整合为解析玉米冷调控网络的拓扑架构提供了强大工具。这种组合策略为冷响应背后的分子和代谢变化提供互补见解。整合这些数据集有助于鉴定核心调控网络节点并帮助生成关于哪些分子变化可能贡献于冷响应的假设。
3.7.2. 冷胁迫玉米根系中的糖代谢重编程
在玉米中，B73根系10 °C冷处理0、6、12、24和48 h的联合转录组和代谢组分析揭示大量差异表达基因和差异代谢物。后者主要涉及淀粉–蔗糖代谢（果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖）、三羧酸循环（柠檬酸、苹果酸、琥珀酸）和氨基酸代谢（脯氨酸、GABA、天冬酰胺）。富集于淀粉–蔗糖和苯丙烷通路的基因在处理根系中表现出显著的冷诱导差异表达。
果糖、葡萄糖和其他可溶性糖在低温下在玉米根系中大量积累，多个控制淀粉和蔗糖代谢的基因同时上调。这些观察暗示糖代谢重编程可能构成玉米根系低温胁迫下的核心适应策略。可溶性糖可能发挥双重作用——作为降低胞内冰点的渗透保护剂和作为激活下游防御反应的信号分子。
3.7.3. 糯玉米冷萌发期间的类黄酮代谢
糯玉米冷萌发的多组学研究揭示耐冷自交系在植物激素和MAPK信号通路相关基因方面表现出比冷敏感对应物更强的转录诱导。在代谢水平，耐冷种质在低温下积累显著更高水平的类黄酮——包括木犀草素、芹菜素、山奈酚和槲皮素——相对于敏感品系具有显著更大的倍数变化。
整合基因和代谢物的相关网络分析揭示关键苯丙烷和类黄酮生物合成酶（PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、FLS）的表达与类黄酮积累之间强正相关。MAPK信号级联和类黄酮生物合成通路似乎协同相互作用，可能形成有助于低温下种子萌发的适应机制。多组学分析平台已被广泛采用以挖掘非生物胁迫下玉米候选耐冷基因，为核心冷调控因子的功能表征提供可靠技术工具。类黄酮可能通过ROS清除减轻膜脂过氧化损伤，为通过代谢操作工程化耐冷玉米提供潜在可行靶标。
3.7.4. 多层玉米冷调控网络的整合模型
在质膜冷信号感知后，钙信号、MAPK级联（包括非典型ZmBSK4–ZmMAPK4通路）和蛋白磷酸化/稳定性控制将信号 relay 至涉及ZmICE1、COOL1、HSF21和NAC家族成员的转录因子网络。同时，转录输出受染色质重塑、组蛋白修饰和miRNA介导的转录后调控调节。总之，这些互连层被提出协调代谢重编程、抗氧化防御和膜脂稳态以增强玉米耐冷性。
4. 耐冷性遗传改良与育种策略
4.1. 优良等位变异的挖掘与分子标记开发
4.1.1. COOL1
HapA的育种应用
优良等位变异的发现构成分子育种的关键第一步。在当前可用等位基因中，COOL1
HapA代表改善耐冷性最有前景的资源之一。COOL1启动子的自然多态性将玉米种质分为HapA和HapB两个单倍型，HapA赋予显著增强的耐冷性，因此特别适合高纬度冷季种植种质的遗传改良。利用COOL1启动子功能变异开发的KASP标记可实现高通量单倍型分型。目前正在进行标记辅助回交以将COOL1
HapA导入北方早熟优良自交系和商业品种，目标是产生新型耐冷种质。初步田间观察已证实导入材料在早春低温条件下出苗稳定性改善。然而这些观察仍然有限，该效应跨遗传背景、地点和年份的稳定性有待系统评估。此外，COOL1
HapA相关的潜在多效性和产量损失需在大规模品种开发前进一步评估。
4.1.2. ZmICE1的增强子启动子标记
ZmICE1启动子MYB39结合位点内的功能SNP（?465 A/C）改变ZmMYB39的结合亲和力，从而影响ZmICE1表达和玉米耐冷性，使该变异与育种高度相关。在自然群体中，携带高表达启动子等位基因的自交系通常与优越耐冷性相关。在219个自交系中的203个被分类为HapA和HapB，冷处理下HapA亚组ROS积累通常高于HapB亚组，暗示HapB可能赋予耐冷优势。针对该SNP开发的位点特异性分子标记促进通过标记辅助选择对育种群体中优良耐冷单倍型的高通量筛选。然而，该标记在不同遗传背景和环境中的预测价值需进一步验证，其对产量和其他农艺性状的潜在影响应在育种计划大规模部署前通过多环境田间试验仔细评估。
4.1.3. HSF21和TIP4;3的优良单倍型
HSF21
Hap1代表耐冷性改良的有前景等位变异，因其据报道在萌发和幼苗阶段均增强抗冷性且不产生产量损失。基于HSF21启动子SNP和InDel开发的分子标记已在多个育种群体中部署以跟踪和选择该有益单倍型。TIP4;3的有利单倍型源于其启动子区域CACTA转座子插入，该插入表观遗传抑制TIP4;3转录并提高耐冷性。然而，这些效应在不同环境和遗传背景中的稳定性以及与水分利用效率和其他性状的可能权衡需通过多环境田间试验进一步研究。它们在优良育种背景中的表现和潜在多效性或产量损失也有待系统评估。
4.1.4. 标记辅助选择的优化策略
标记辅助选择（marker-assisted selection, MAS）已被证明对多种作物的耐冷育种高度有效。然而，单位点MAS对耐冷性等多基因性状的增益有限。近期发展的基因组选择（genomic selection, GS）策略利用均匀分布全基因组的标记预测育种值，对玉米抗冷育种具有相当前景。综合综述已系统总结DNA标记、GS和基因编辑技术在作物遗传改良中的应用，为完善玉米育种策略提供理论指导。然而，其实际有效性严重依赖表型准确性、基因型×环境互作和训练群体的代表性，GS预测准确性通常具有群体特异性且在遗传分化材料中可能下降。因此，将这些方法与多环境表型分析和长期产量评估相结合对于将分子预测转化为实际品种改良至关重要。
4.2. 野生近缘种遗传资源的挖掘与利用
循环经济玉米农业（Circular Economy Corn Agriculture, CERCA）框架近期被提出。该倡议的核心目标是开发能够在春季土壤温度低于10 °C时播种的耐冷玉米品种，从而延长生长季并更充分利用C4光合作用的产量潜力。模型预测表明克服苗期耐冷性限制可将播种期提前15–20天，谷物产量提高10%以上，并减少春季土壤氮淋溶损失20%。该倡议主张从野生玉米近缘种挖掘冷适应遗传资源，部署基因编辑将有益变异引入栽培种质，并聚合耐冷性和氮利用效率基因——如ZmDof1、ZmNAC4和ZmGS1——以实现早播稳定性和减少氮肥投入的双重目标。这些预测基于模型模拟，尚未通过多环境田间试验验证；此类品种在多样环境条件下的实际表现有待确定。
多年生玉米被认为是耐冷野生种质的有前景来源。比较转录组方法已被应用于筛选该材料中的冷特异性响应基因，相关优良基因的鉴定有望为改善栽培玉米抗冷性提供新资源。然而，将野生等位基因导入优良种质常面临连锁累赘、遗传不亲和和不可预测的上位互作等挑战，可能限制这些资源的实际效用。
4.3. 耐冷性基因聚合与超级耐冷品种展望
4.3.1. 基因聚合的理论基础
耐冷性是多基因性状，单基因修饰通常仅产生中等表型改善。聚合多个优良耐冷等位基因可产生加性或协同效应。理论上，在无不利遗传连锁且遗传背景兼容的情况下，结合COOL1
HapA（减弱负调控）、高表达ZmICE1启动子变异（增强正冷信号级联）和TIP4;3有益单倍型可产生比单基因品系更优越耐冷性的种质。然而，这些预测效应很大程度上是理论性的；聚合品系的实际表现取决于复杂的上位互作、遗传背景效应和环境条件，均需广泛田间验证。
4.3.2. 聚合策略的优化
然而在实践中，基因聚合面临若干挑战。首先，耐冷性与早熟和产量等农艺性状之间存在遗传权衡。值得注意的是，优良HSF21
Hap1等位基因同时增强抗冷性而无产量损失，证实精确调控脂质代谢稳态可协调抗逆性与产量形成之间的拮抗。某些抗冷基因的组成型过表达常引发不良多效性，包括生物量降低和生长周期延长；例如，ZmCBF过表达品系表现矮化和延迟开花。该瓶颈可通过使用组织特异性启动子缓解——例如，萌发特异性LEA启动子驱动ZmCBF表达——通过空间和时间限制的转基因活性增强耐冷性同时避免发育缺陷。其次，不同胁迫响应通路之间存在复杂互连：耐冷性和抗旱/抗病性有时协同（如ABA信号同时调控冷和干旱适应），有时拮抗（如水通道蛋白调控：抑制TIP4;3改善耐冷性但可能损害水分利用效率）。未来分子设计育种必须采用全周期、多胁迫视角构建赋予多种胁迫韧性的基因网络。此外，聚合品系在田间条件下的表现受基因型×环境互作影响且可能因地点和年份而异，凸显品种释放前多环境测试的必要性。
4.4. 协调耐冷性与其他胁迫响应的整合育种
4.4.1. 耐冷性与磷利用效率的双重改良
协调改善耐冷性与其他胁迫响应的调控机制已成为育种研究的突出前沿。耐冷性与磷获取效率之间存在遗传权衡：低温降低土壤磷扩散速率和微生物活性，从而降低磷生物有效性，而某些抗冷通路的持续激活进一步抑制磷吸收。该拮抗的分子基础已被阐明：在低温下，E3连接酶NLA同时通过JAZ11降解激活JA介导的耐冷性并通过降解磷酸转运蛋白PT4抑制磷吸收。基因编辑介导的NLA功能重塑产生NLAΔ12变体消除该负遗传相关，同时增强耐冷性和磷利用效率，从而建立玉米多性状协调改良的理论范式。然而，该策略迄今主要在受控条件下测试；其在田间的有效性、潜在多效性和与多样遗传背景的兼容性有待确定。
4.4.2. 冷、干旱和抗病性的协同网络
冷和干旱耐受性在ABA信号水平共享协同调控基础。耐冷性与抗病性之间的关系更为复杂：NPR1和WRKY等防御相关转录因子也参与冷响应，而在玉米中，冷响应因子ZmDREB1A负调控抗病性，揭示耐冷性与免疫之间的权衡。
解析控制多种非生物和生物胁迫的遗传相关和分子汇聚点将促进能够组合抵御冷、干旱、低磷和其他田间逆境的“气候韧性”玉米品种育种。Yu及其同事结合SLAF-seq与混合分组分析（bulked segregant analysis, BSA）解析控制玉米萌发期耐冷性的QTL，为协调多性状育种提供分子标记资源。然而，将这些发现转化为实际品种需要整合多环境表型分析、产量评估和农艺表现，这仍是复杂胁迫耐受分子育种的关键瓶颈。
5. 结论与未来展望
5.1. 主要研究进展与贡献
近年来玉米耐冷性分子解析取得实质性进展。在核心基因发现层面，该领域已积累越来越多具有明确育种潜力的功能验证基因。ZmICE1通过重塑胞内氨基酸代谢平衡调节冷适应性；COOL1自然变异阐明了玉米适应高纬度寒冷环境的进化轨迹；HSF21通过稳定膜脂稳态增强耐冷性且不产生产量损失。其他调控因子——包括ZmWAK3、液泡膜水通道蛋白TIP4;3和功能未表征蛋白ZmDUF966-10——已被陆续鉴定，大幅扩展耐冷性遗传资源库。这些基因涵盖从转录因子和受体激酶到热激调控因子和水通道蛋白的多种功能类别，共同例证玉米冷响应调控网络的多面复杂性。
在信号转导和网络解析方面，非典型ZmBSK4–ZmMAPK4激酶级联的发现挑战了经典三层MAPK磷酸化级联的传统观点。多层调控现已被系统表征，包括钙和MAPK信号之间的交叉对话、通过组蛋白修饰的表观遗传调节、小RNA的转录后精细调节以及广泛的激素通路相互作用。这些互连调控层共同构成支撑玉米冷适应的综合信号系统，深化了对植物冷响应程序的整体理解。
在转化层面，COOL1、HSF21、TIP4;3和其他基因的优良自然单倍型已成为分子育种的优先靶标。CRISPR/Cas9技术的持续进步现不仅实现简单基因敲除，还实现精确等位基因替换和蛋白功能靶向修饰。新型育种框架——包括多基因聚合和基因组选择——为同时改良耐冷性和谷物产量等复杂农艺性状提供可行策略。总之，这些理论和技术进展推进了基础植物冷生物学知识，同时为培育耐冷玉米品种提供明确定义的基因靶标和成熟分子工具。
5.2. 持续瓶颈与未解决挑战
尽管取得相当进展，若干瓶颈和关键科学问题仍未解决。
第一，优良耐冷等位基因的表型效应强烈依赖遗传背景。将ZmICE1和COOL1等主效基因导入不同自交系产生显著可变的耐冷性增益；例如，引入COOL1优良单倍型在热带种质中赋予的改善远大于温带材料。 underlying 原因包括种质背景间内在级联激活强度、代谢网络架构和表观遗传修饰模式的差异。因此，仅基于回交的导入无法在所有育种材料中可靠实现预测的耐冷性改善，需要背景定制的基因组选择策略。
第二，玉米驯化过程中进化的自然冷适应机制常与现代高产育种目标相悖。耐冷COOL1
HapA单倍型起源于野生类蜀黍并通过自然和人工选择在温带和冷温带种质中积累。然而大多数广泛种植的高产品种携带冷敏感单倍型，表明耐冷性状在现代育种中被无意反向选择。抗冷位点常与早熟、株型和生育期等关键产量相关性状显示不利连锁。简单导入野生衍生等位基因常引入有害农艺性状，传统回交无法有效打破连锁累赘。因此需要在分子水平重新设计调控通路以协调抗冷性与高产之间的拮抗。
第三，大多数现有研究集中于孤立冷胁迫，而田间环境通常涉及多种并发胁迫的组合。低温常与干旱、营养限制和病虫害压力同时发生，产生复杂的协同或拮抗相互作用，其调控逻辑仍知之甚少。例如，ABA信号同时增强冷和干旱耐受性，但持续过度激活抑制正常生长并降低最终产量。阐明多种农艺性状之间的遗传权衡是协调改善多胁迫韧性和高产的前提。
第四，实验室发现与田间应用之间仍存在显著差距。大多数耐冷基因已在受控温室条件下验证，而田间设置引入温度波动、光照不均、土壤养分变异和生物干扰等混杂变量。室内观察到的抗冷优势在田间复杂性下常大幅减弱。建立模拟真实田间环境的标准化表型平台并在多个生态区进行聚合品系的适应性筛选仍是连接基础研究与育种实践的关键瓶颈。
5.3. 未来研究方向与展望
为填补这些差距，提出五个前沿研究方向供未来研究。第一，合成生物学具有人工重建冷调控级联的潜力。通过组装COOL1光信号启动子元件、ZmICE1冷响应增强子序列、抗冻蛋白基因和抗氧化生物合成基因可构建逻辑门控合成基因回路，实现冷和光双信号触发的冷防御响应协调激活。液–液相分离近期已成为植物新型冷感知机制：转录因子通过相分离形成生物分子凝聚体以在水稻中启动冷转录程序，但该调控模式在玉米中尚未探索。未来工作可研究相分离是否贡献于玉米冷响应并利用合成生物学工程化人工相分离系统以靶向增强耐冷性。
第二，应推进多胁迫和全生长周期研究与高通量表型组学的整合。覆盖整个生命周期——从萌发到灌浆——的表型平台可配备可见光、红外、高光谱和叶绿素荧光成像，以实现耐冷性状及其与干旱和抗病性遗传关系的自动化高通量量化。大规模多环境、多基因型数据集可用于训练基因组选择模型，加速多个优良耐冷等位基因的聚合并促进转化育种。
第三，单细胞和空间转录组学可解析被 bulk 组织分析掩盖的细胞类型特异性冷响应。单细胞RNA-seq和空间转录组技术可描绘保卫细胞、根尖分生组织细胞、维管束鞘细胞和其他特化群体中运作的独特冷响应程序，并可解析细胞间信号传递网络。此类知识将实现关键组织耐冷性的靶向增强同时避免全局生长抑制。
第四，更充分利用野生玉米种质和开发从头驯化策略代表有前景的途径。传统育种通常将野生类蜀黍的耐冷基因导入栽培玉米，常伴随不利连锁基因组片段。从头驯化——使用基因编辑直接修饰野生近缘种——可快速产生结合完整天然抗冷网络与高产特性的新型种质，规避连锁累赘并为抗冷育种开辟新途径。
第五，应利用人工智能和多组学大数据整合加速基因发现。日益丰富的玉米基因组、转录组、代谢组和表型组数据集在深度学习 and 图神经网络分析时提供强大预测能力。这些工具可预测基因功能和调控关系、预测未表征基因的耐冷功能，并将大量文献组织为连接基因与农艺性状的知识图谱——从而支持育种计划设计的智能决策。
5.4. 结语
总之，玉米耐冷性分子调控网络研究正从单基因表征向人工网络重建和分子设计育种时代过渡。基础机制研究和转化育种应用的协同推进，在基因编辑、合成生物学、多组学整合、人工智能和高通量表型组学等前沿技术赋能下，有望在未来5–10年加速耐冷玉米品种的开发和部署，为全球粮食安全和可持续农业发展提供有力支撑。同时，对早期冷信号感知、表观遗传胁迫记忆和交叉胁迫适应机制等基础问题的持续研究将继续推动植物胁迫生物学更广泛领域的进展。
