紫花苜蓿CDPK基因家族全基因组分析揭示MsCDPK9.Zm1正向调控苜蓿生理耐盐性

《Agronomy》：Genome-Wide Comprehensive Analysis of the CDPK Gene Family in Three Alfalfa Germplasms Revealed That MsCDPK9.Zm1 Positively Regulates the Physiological Salt Tolerance of Alfalfa

　　

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是一种广泛栽培的多年生饲用豆科植物，但其生产力受到土壤盐渍化的严重制约。钙依赖蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases，CDPKs）在植物盐胁迫信号传导中发挥关键作用；然而，紫花苜蓿中CDPK基因家族的系统性鉴定及其成员的功能验证仍十分有限。本研究对三种紫花苜蓿种质中的CDPK基因家族进行了全基因组鉴定与功能表征。研究人员分别在紫花苜蓿‘中苜1号’（M. sativa ‘Zhongmu No. 1’）、‘中苜4号’（M. sativa ‘Zhongmu No. 4’）和天蓝苜蓿亚种（M. sativa subsp. caerulea）中鉴定出18、90和26个MsCDPK成员，并基于系统发育分析将其划分为四个亚家族。共线性分析揭示，片段重复（segmental duplication）是MsCDPK基因家族扩张的主要驱动力，而未检测到串联重复（tandem duplication）事件。值得注意的是，表达模式分析鉴定出MsCDPK9.Zm1为盐响应基因。在紫花苜蓿中过表达MsCDPK9.Zm1显著增强了生理耐盐性，表现为盐胁迫下抗氧化酶活性升高和氧化损伤降低。荧光素酶互补成像（luciferase complementation imaging，LCI）实验进一步支持MsCDPK9.Zm1与RBOHB之间存在物理互作。这些发现加深了研究人员对紫花苜蓿CDPK基因家族的理解，并将MsCDPK9.Zm1确定为耐盐紫花苜蓿分子育种的候选基因。

紫花苜蓿CDPK基因家族全基因组解析及MsCDPK9.Zm1耐盐功能验证

一、研究背景与科学问题

土壤盐渍化是制约全球农业生产的重要非生物胁迫因素之一。紫花苜蓿（Medicago sativa L.）作为广泛栽培的多年生饲用豆科植物，其产量和品质深受土壤盐渍化影响，造成显著的经济损失。因此，解析苜蓿耐盐的分子机制并挖掘关键耐盐基因，对培育耐盐种质和保障可持续饲草生产具有重要意义。

在植物应对逆境胁迫的信号网络中，钙离子（Ca²⁺）作为保守的第二信使发挥核心作用。钙依赖蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases，CDPKs）是植物中三大类Ca²⁺传感器之一，其独特之处在于将Ca²⁺感知与激酶效应域整合于同一蛋白中，能够直接将Ca²⁺信号转化为下游靶标的磷酸化事件。CDPK蛋白包含N端可变域、丝氨酸/苏氨酸激酶域、自抑制连接域和含1至4个EF-hand基序的C端类钙调素域。静息状态下自抑制域封闭激酶活性位点，胁迫诱导Ca²⁺浓度升高后，Ca²⁺与EF-hand基序结合引发构象变化，释放激酶活性以磷酸化下游底物。

已有研究表明，CDPK基因通过多种信号通路调控植物耐盐性，包括ABA信号传导、气孔运动调节、活性氧（reactive oxygen species，ROS）稳态维持以及次生代谢物合成等。然而，紫花苜蓿中CDPK基因家族的系统性表征和成员功能验证仍十分有限。基于此，研究人员开展了本研究。

二、主要技术方法

研究人员利用MODMS数据库获取紫花苜蓿‘中苜1号’、‘中苜4号’及天蓝苜蓿亚种（M. sativa subsp. caerulea）的基因组数据，通过InterPro的EF-hand（PF13499）和激酶（PF00069）隐马尔可夫模型结合TBtools v2.498进行hmmsearch筛选，并经NCBI-CDD和SMART双重结构域验证鉴定CDPK家族成员。系统发育分析采用MEGA 7.0的MUSCLE比对和最大似然法（JTT模型，1000次bootstrap）。顺式元件分析利用PlantCARE在线工具。共线性分析采用TBtools的One Step MSCanX插件。表达分析基于MODMS数据库盐胁迫RNA-seq数据（源自Luo等的研究）及qRT-PCR验证。功能验证采用酵母异源表达（INVSc1菌株）、紫花苜蓿遗传转化（农杆菌EHA105介导）、亚细胞定位（本氏烟草瞬时表达）、生理指标检测（SOD、POD、CAT活性及O₂^?、MDA、H₂O₂含量）以及STRING数据库预测、AlphaFold3复合物结构预测和荧光素酶互补成像（LCI）实验。

三、主要研究结果

3.1 三种苜蓿种质中MsCDPK家族的鉴定与染色体定位

在‘中苜1号’、天蓝苜蓿亚种和‘中苜4号’基因组中分别鉴定出18、26和90个MsCDPK基因家族成员。在单倍型解析的‘中苜4号’组装中，90个基因经BLASTP聚类（≥85%一致性）可归并为23个位点，与二倍体天蓝苜蓿亚种的26个位点相当。所有CDPK蛋白均含STKc_CAMK激酶域和至少3个EF-hand结构域。理化性质分析显示三个种质中MsCDPK蛋白均以亲水性蛋白为主。染色体定位显示‘中苜1号’和天蓝苜蓿亚种中Chr2和Chr6无MsCDPK基因分布，而‘中苜4号’中仅Chr2.2、Chr6.2和Chr6.4缺失。

3.2 MsCDPK基因家族系统发育树的构建

整合蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）及四个苜蓿种质的CDPK序列构建系统发育树，将CDPK基因划分为四个亚家族（I、II、III和IV），其中亚家族I和II成员数最多（各67个），亚家族IV最少（13个）。

3.3 MsCDPK基因家族顺式作用元件分析

启动子区域鉴定出大量非生物胁迫相关元件，包括TC-rich repeats（防御和胁迫响应）、LTR（低温响应）、ABRE（脱落酸响应）和ARE（厌氧诱导），其中干旱诱导相关元件MBS占比相对较高。

3.4 不同苜蓿种质中MsCDPK基因家族的共线性分析

种内共线性分析在‘中苜1号’、‘中苜4号’和天蓝苜蓿亚种中分别鉴定出4、65和3对共线性基因，全部来源于片段重复，未检测到串联重复事件。种间共线性分析显示，‘中苜1号’中16、15、14和15个MsCDPK基因分别与‘新大叶’、‘中苜4号’、蒺藜苜蓿和天蓝苜蓿亚种存在共线性对应关系。

3.5 MsCDPK基因家族基因结构与保守基序分析

基序分析显示Motif 1存在于所有基因中。除亚家族II的MsCDPK6.Zm1和亚家族IV的MsCDPK16.Zm1的基序分布和类型与同亚家族其他成员显著不同外，其余成员与同亚家族成员基本一致。基因结构分析显示同亚家族成员间外显子数量和分布具有相似性。

3.6 盐胁迫下苜蓿MsCDPK基因家族的qRT-PCR分析

基于MODMS数据库分析发现MsCDPK6.Zm1、MsCDPK8.Zm1、MsCDPK9.Zm1、MsCDPK10.Zm1和MsCDPK14.Zm1响应盐胁迫，其中MsCDPK9.Zm1响应最为显著。qRT-PCR验证显示五个基因在盐胁迫后表达均升高，除MsCDPK8.Zm1在12小时达峰外，其余四个基因均在1小时达峰。MsCDPK9.Zm1表现出最强的盐胁迫诱导。

3.7 MsCDPK9.Zm1的亚细胞定位及转基因酵母功能验证

MsCDPK9.Zm1全长1512 bp，编码503个氨基酸。亚细胞定位显示MsCDPK9.Zm1定位于细胞核。酵母异源表达实验表明，在200 mmol/L NaCl胁迫下，表达MsCDPK9.Zm1的酵母OD600在8至12小时显著高于空载体对照，且在固体培养基上表现出更好的生长能力，证实其异源系统中保留耐盐功能。

3.8 MsCDPK9.Zm1过表达显著影响苜蓿耐盐性

在200 mmol/L NaCl处理7天后，过表达株系（MsCDPK9.Zm1-OE1和OE2）的O₂^?含量分别比野生型（WT）低31.28%和34.05%，MDA含量低17.19%和20.17%，H₂O₂含量低25.39%和21.76%。同时，过表达株系的POD活性（OE1高11.79%）、SOD活性（高36.55%和37.71%）和CAT活性（高10.89%和18.99%）均显著高于WT。表明MsCDPK9.Zm1过表达增强了抗氧化防御能力并减少了盐胁迫下的氧化损伤。

3.9 MsCDPK9.Zm1与RBOHB互作

STRING数据库预测出5个潜在互作蛋白，AlphaFold3复合物结构预测显示MsCDPK9.Zm1与MsG0180004596.01（RBOHB）的复合物置信度最高（ipTM=0.47，pTM=0.44）。LCI实验证实nLUC-MsCDPK9.Zm1与cLUC-RBOHB共表达区域产生荧光信号，支持两者间的物理互作。

四、讨论与结论

讨论部分指出，三个种质中MsCDPK基因数量差异归因于倍性和组装状态的不同。共线性分析证实片段重复是MsCDPK基因家族扩张的主要驱动力，这与花生、梅花等植物中的研究结果一致。MsCDPK9.Zm1通过增强抗氧化酶系统、降低ROS积累来提升耐盐性，这与拟南芥AtCDPK27、小麦TaCDPK27等已知CDPK功能相吻合。RBOHB属于呼吸爆发氧化酶同源物（RBOH）家族，是NADPH氧化酶超家族中负责质外体ROS产生的核心组分，CDPK介导的RBOH蛋白磷酸化在植物中具有保守性。MsCDPK9.Zm1与RBOHB的物理互作提示两者可能共同参与盐诱导的ROS响应通路。

研究结论：本研究对三种苜蓿种质中的CDPK基因家族进行了全基因组分析，分别鉴定出18、90和26个MsCDPK成员，系统发育分析将其划分为四个亚家族。共线性分析揭示片段重复是基因家族扩张的主要驱动力。盐胁迫表达谱鉴定出MsCDPK9.Zm1为持续上调的盐响应基因。酵母异源表达和苜蓿过表达均证实其通过增强抗氧化防御系统提升生理耐盐性。LCI实验支持MsCDPK9.Zm1与RBOHB的物理互作。这些发现为理解苜蓿CDPK介导的耐盐机制奠定基础，并为耐盐苜蓿分子育种提供候选基因。