氯化汞单独及联合n-3长链多不饱和脂肪酸体外暴露对系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞Th17相关免疫应答的影响

《Journal of Immunotoxicology》：In-vitro exposure to mercury chloride, with and without n-3 long chain polyunsaturated fatty acids, on the Th17-associated immune response in peripheral blood mononuclear cells from systemic lupus erythematosus patients

　　

Th17细胞因子参与系统性红斑狼疮（SLE）的发病机制。汞是一种与环境相关的因素，与SLE病情的加重有关，其可能通过调控Th17通路发挥作用。人类主要通过牙科汞合金和鱼类消费接触汞。鱼类同时也是n-3长链多不饱和脂肪酸，即二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）的丰富来源，并已被证明可减轻SLE疾病症状。本初步体外研究从SLE患者（N=15）和健康对照者（HC，N=15）中分离外周血单个核细胞（PBMC）。细胞经脂多糖（LPS）刺激，并暴露于200 nM氯化汞（HgCl）24小时，在暴露前或不暴露前（24小时）分别预暴露于100 μM的EPA或DHA。对PBMC上清液中的Th17相关细胞因子进行定量检测。与HC（51.63[±42.96] pg/mL）相比，经EPA预暴露的SLE患者LPS-HgCl处理PBMC上清液中IL-27浓度显著降低（29.58[±22.62] pg/mL）（p=0.04）。虽然DHA-LPS-HgCl处理使SLE患者和HC的PBMC中IL-27浓度较LPS-HgCl显著降低，但组间无显著差异。IL-27对免疫系统表现出促炎/抗炎双重效应。研究人员认为，所观察到的EPA-LPS-HgCl处理后IL-27浓度降低支持n-3多不饱和脂肪酸在自身免疫应答中的保护作用。

系统性红斑狼疮（SLE）是一种病因复杂的慢性多系统自身免疫性疾病。尽管遗传因素具有明确影响，但双生子家系研究证据表明，环境刺激在疾病发生和进展中均发挥关键作用。SLE发病机制中涉及的免疫细胞激活确切顺序尚不清楚。辅助性T细胞17（Th17细胞）是一类新型辅助性CD4+细胞，分泌白细胞介素（IL）-17A、IL-17E、IL-17F、IL-21和IL-22，既往已被证实与SLE疾病活动度相关。IL-33是一种警报素细胞因子，由多种细胞分泌，在动物模型中已被证明可靶向Th17细胞分化和IL-17A表达。SLE患者中IL-33及其受体ST2浓度显著升高，并与其他促炎标志物和疾病活动度相关。汞是一种免疫毒素，被认为是参与SLE疾病启动和加重的一种环境因素。迄今支持汞在自身免疫中作用的最有力证据来自动物模型。具体而言，遗传性金属易感小鼠暴露于有机汞和无机汞（iHg）后，出现与SLE病理相似的特征，即免疫球蛋白G（IgG）自身抗体产生增加和CD4+ T细胞扩增。人类观察性研究表明，通过职业和牙科汞合金接触iHg与SLE风险增加相关。然而，iHg并未显示与SLE疾病活动度相关。人类接触汞的主要形式是通过鱼类消费摄入的有机形式甲基汞（MeHg）。全球五分之一的人口以鱼类作为日常蛋白质来源。因此，MeHg暴露是一个公共卫生问题。流行病学证据发现，健康参与者队列中MeHg暴露增加与抗核抗体和促炎细胞因子升高相关。众所周知，在考察鱼类消费中汞的有害效应时，需要考虑鱼类中同时存在的有益成分，如n-3长链多不饱和脂肪酸（LCPUFA），特别是二十碳五烯酸（EPA，C20:5）和二十二碳六烯酸（DHA，C22:6）。在高鱼类消费人群中，n-3 LCPUFA似乎可减轻MeHg相关的炎症。但这些研究未调查Th17炎症标志物，值得进一步研究。既往自身免疫性疾病动物模型证据表明，与对照组相比，每日摄入2 g n-3 LCPUFA持续2周可显著降低Th17细胞分化和IL-17A产生。一项体外实验报告，100 μM n-3 LCPUFA可显著降低健康参与者分离细胞的IL-17A产生。同样，自身免疫性疾病患者分离的细胞在暴露于EPA后Th17细胞频率显著降低。这些抗炎特性也已被证明可有效改善SLE患者的促炎细胞因子和疾病活动度，显示n-3多不饱和脂肪酸是管理疾病活动度的一种有吸引力的治疗手段。由于鱼类是n-3 LCPUFA的主要膳食来源，确定鱼类对SLE患者的益处是否大于潜在风险（如MeHg）具有公共卫生重要性。研究团队既往的一项体外研究发现，在暴露于MeHg后，预暴露于n-3 LCPUFA可显著降低SLE患者和健康对照者（HC）分离的外周血单个核细胞（PBMC）中的Th1细胞因子浓度。本初步体外研究旨在探讨氯化汞（HgCl）暴露伴或不伴n-3 LCPUFA对SLE患者与HC相比PBMC释放Th17相关细胞因子的影响。研究经研究伦理委员会办公室批准（20/NS/0039）。招募确诊为SLE的参与者（N=15），须符合由顾问风湿病学家核实的美国风湿病学会11项诊断标准中至少4项。若SLE患者目前服用泼尼松龙剂量>10 mg、处方非甾体抗炎药或补充n-3 LCPUFA则被排除。招募HC（N=15），并按年龄（±5岁）、性别（男/女）和BMI（同一类别）与每位SLE患者匹配。若HC有自身免疫性疾病史、目前患有急性疾病、目前服用非甾体抗炎药或补充n-3 LCPUFA则被排除。SLE疾病活动度通过以下工具测量：英国群岛狼疮评估组（BILAG），评分超过12表示疾病非常活跃，6-11表示中度活跃，2-5表示轻度活跃，0-1表示疾病不活跃；系统性狼疮活动性测量修订版（SLAM-R），评分>7视为具有临床意义；以及系统性红斑狼疮疾病活动指数-2000（SLEDAI-2K），评分<3表示轻度疾病，3-6表示中度疾病，>6表示重度疾病。氯化汞（HgCl）作为iHg的常用类似物，出于安全考虑（与高毒性MeHg相比）使用，溶解于无菌去离子水中，储备浓度为3 mM。HgCl储备液进一步稀释至工作浓度200 nM，相当于37 μg/L，与高鱼类消费人群中可达到的暴露浓度相似。EPA和DHA各自溶解于乙醇中，浓度为30 mM，储存于?80°C。实验当日，EPA和DHA用添加1%热灭活胎牛血清（hi-FBS）、2% w/v牛血清白蛋白和1%乙醇的罗斯威尔帕克纪念研究所培养基（RPMI）1640稀释。EPA和DHA混合物涡旋10分钟，并在37°C孵育2小时后用于PBMC培养。脂多糖（LPS）用磷酸盐缓冲盐水（PBS）配制，储备浓度为1 mg/mL，储存于?80°C。所有实验使用同一批次的LPS等分试样。所有化学品购自Merck，除非另有说明。PBS购自Thermo Fisher Scientific（Waltham，MA）。通过静脉穿刺从参与者前臂正中静脉采集非空腹血样至3×9 mL肝素钠管中。如前所述，将血样合并至装有Ficoll-Paque Premium介质的LeucoSep管中，以1500×g离心15分钟。分离PBMC缓冲层，用PBS和RPMI 1640洗涤。PBMC以7.5×10⁵的密度维持培养于添加25 mM 4-(?2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、10% hi-FBS、5%青霉素链霉素和5% L-谷氨酰胺的RPMI 1640中。将100 μM EPA、100 μM DHA或溶剂对照加入RPMI培养基与PBMC混合物中，在37°C、5% CO₂条件下孵育24小时。孵育期结束后，加入200 nM HgCl和50 ng/mL LPS或溶剂对照，再孵育24小时。回收细胞混合物，离心，分离细胞上清液并储存于?80°C直至分析。既往工作已确定200 nM HgCl对这些类型PBMC无细胞毒性。为确保炎症细胞因子的变化并非源于非特异性细胞毒性，将每位参与者的100 μl细胞等分试样和100 μl RPMI 1640加入96孔板。每孔加入15 μl浓度为500 μg/mL的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物（MTT），在37°C孵育4小时。然后加入100 μl 10% Triton-X的酸性异丙醇-2（增溶溶液）至细胞混合物中，在37°C再孵育2小时。在VersaMax酶标仪上于570 nm和630 nm波长测量吸光度，以光密度（OD）表示。如前所述，该试验基于活细胞将四唑盐代谢为紫色甲臜的原理。通过基于电化学发光的Meso Scale Discovery（MSD）免疫分析检测LPS刺激的PBMC分泌的IL-17A、IL-17E/IL-25、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、IL-31和IL-33的浓度。MSD板在MSD QuickPlex SQ120上分析，浓度使用制造商软件计算；结果以均值（±SD）表示，单位为pg/mL。IL-17A、IL-17E/IL-25、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、IL-31和IL-33的检测下限（pg/mL）分别为2.1、0.58、160、1.2、0.13、1.4、9.6、7.3和0.59。浓度低于检测下限（LLOD）的样本以LLOD/√2输入。使用社会科学统计软件包（SPSS）版本31.0进行统计比较，Prism版本11软件（GraphPad，San Diego，CA）用于展示结果。描述性统计包括年龄、体重指数（BMI=体重(kg)/身高(m)²），以均值和标准差报告。Shapiro-Wilk检验用于评估细胞因子分布，偏态数据进行转换后分析。细胞因子浓度以原始均值（±SD）呈现。MTT试验的平均OD值转换为百分比变化，每种细胞因子处理的细胞活力使用方差分析（ANOVA）评估。本研究的主要目的是评估暴露于HgCl和LPS的Th17相关细胞因子浓度的差异。进行协方差分析（ANCOVA），控制LPS。次要目的是研究预暴露于EPA或DHA是否对HgCl暴露后预期的炎症反应具有保护作用。该目的分别评估EPA和DHA，同时控制HgCl和LPS暴露。每次实验中的细胞因子差异分别在SLE或健康对照组内使用配对样本T检验进行比较。p<0.05视为具有统计学显著性。参与者描述性特征，包括SLE队列的临床疾病指标，已总结。SLE患者平均年龄[±SD]为42.13[±9.20]岁，匹配对照为42.33[±8.60]岁。SLE患者被归类为疾病活动，BILAG平均[±SD]评分为14.00[±6.01]，SLAM-R为9.27[±3.28]，SLEDAI-2K为8.07[±3.22]。MTT试验结果显示阴性对照的平均吸光度为0.2 OD。MTT试验证实，与仅培养基中的细胞相比，暴露于各种处理条件的细胞活力未受显著影响。与未刺激对照（仅培养基）相比，细胞活力的平均变化为：仅LPS=+3，仅HgCl=+19，HgCl和LPS=+3，EPA、HgCl和LPS=+11，DHA、HgCl和LPS=+11。在SLE患者来源的PBMC上清液中，HgCl和LPS暴露后IL-27和IL-33浓度较仅LPS刺激的PBMC显著升高（分别为p=0.005和p<0.001）。在HC来源的PBMC上清液中，HgCl和LPS暴露后IL-27浓度较仅LPS刺激的PBMC显著升高（p=0.013）。HC采集的PBMC中，HgCl和LPS暴露后IL-33浓度较仅LPS显著降低（p<0.001）。HgCl暴露后，LPS刺激的PBMC上清液中IL-17A、IL-23或IL-31浓度未见显著差异。任何处理后IL-17E、IL-17F、IL-21和IL-22均未检测到。暴露于EPA、HgCl和LPS的SLE患者PBMC中IL-27浓度（29.58[±22.62] pg/mL）显著低于未预暴露EPA的SLE患者PBMC（37.45[±31.40] pg/mL，p=0.021）。此外，该降低与HC的PBMC（51.63[±42.96] pg/mL，p=0.04）相比具有显著差异。与暴露于HgCl和LPS的细胞相比，EPA、HgCl和LPS暴露使SLE和HC来源细胞的IL-23显著升高（分别为p=0.02和p=0.002）。IL-23浓度的变化在SLE患者和HC之间无显著差异。在HC组中，暴露于EPA、HgCl和LPS的PBMC中IL-33浓度较未预暴露EPA的PBMC显著降低（p=0.01）。IL-17A或IL-31浓度未见显著差异。任何处理后IL-17E、IL-17F、IL-21和IL-22均未检测到。暴露于DHA、HgCl和LPS的SLE患者和HC采集的PBMC中IL-27浓度较未预暴露DHA的HgCl和LPS暴露PBMC显著降低（p<0.001）。IL-27浓度的变化在SLE患者和HC来源细胞之间无显著差异。暴露于DHA、HgCl和LPS的SLE患者PBMC中IL-33浓度较未预暴露DHA的HgCl和LPS暴露SLE患者PBMC显著降低（p=0.004）。IL-17A、IL-23或IL-31浓度未见显著差异。任何处理后IL-17E、IL-17F、IL-21和IL-22均未检测到。本初步体外实验研究考察了HgCl和n-3 LCPUFA对Th17细胞相关细胞因子的影响，这些细胞因子是自身免疫性疾病发病机制的主要contributors。结果提示，HgCl暴露对SLE患者和HC分离的PBMC中IL-17A、IL-23或IL-31产生无影响。HgCl暴露显示可显著增加SLE患者（32.1%）和HC（15.4%）分离PBMC中IL-27的产生。尽管在SLE患者来源细胞中观察到更强的IL-27反应，但与HC细胞相比无显著差异。预暴露于抗炎性EPA似乎可减轻SLE患者细胞中HgCl诱导的IL-27产生，而HC细胞中则不然。IL-17A是Th17细胞产生的标志性细胞因子，与SLE疾病活动度相关，并与狼疮性肾炎患者来源PBMC的免疫学特征相关。研究汞暴露与IL-17A相互作用的研究有限。有研究提示iHg可能通过细胞摄取Hg²⁺离子影响疾病病理，导致凋亡/坏死和炎症。在本研究中，观察到HgCl和LPS暴露未影响分离PBMC中的IL-17A，且所注反应在SLE患者和HC细胞之间无显著差异。一项类似的体外实验报告iHg暴露后PBMC中IL-17A产生显著增加。应注意该研究仅纳入6名健康参与者进行PBMC分离，且48%的样本IL-17A浓度低于检测下限。这可能部分解释了与当前发现的差异。在本研究中，与仅LPS刺激的PBMC相比，SLE患者和HC的PBMC在HgCl和LPS暴露后IL-27浓度显著升高。IL-27已被报道可负向调控Th17应答，导致Th1应答增强和干扰素（IFN）-γ产生。IL-27对Th17细胞分化和Th17细胞因子产生的抑制作用可能潜在地解释HgCl攻击后IL-17A缺乏变化。SLE患者分离PBMC中MeHg暴露导致肿瘤坏死因子（TNF）-α浓度升高。综合来看，这些发现提示MeHg和HgCl暴露均可能促进Th1免疫应答，并支持所假设的机制。迄今为止，IL-27在SLE病理中的作用仍知之甚少，已发表数据有限且相互矛盾。由于这是一项初步体外研究，这些发现的临床意义需要进一步探索。IL-33被归类为警报素，引发Th2细胞应答，并已被证明与SLE疾病活动度相关。SLE患者具有过度活跃的NLRP3炎症小体；MeHg暴露可在体外激活NLRP3炎症小体，进而刺激IL-33产生。本研究发现HgCl暴露导致SLE患者和HC的PBMC中IL-33浓度出现统计学显著但幅度适中的升高。虽然升高幅度较小，但应在这一初步体外研究背景下解读这些发现，未来研究应确定其生物学和临床相关性。PBMC预暴露于EPA或DHA可减轻SLE患者和对照细胞中HgCl诱导的IL-27产生。n-3多不饱和脂肪酸对IL-27的抗炎作用此前已在一项研究中被识别，其中DHA（25 μM和50 μM）通过过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPARγ）以剂量依赖性方式显著降低LPS刺激的树突状细胞中的IL-27。在本研究中，EPA预处理的PBMC中HgCl暴露后的IL-27反应在SLE患者细胞中显著低于HC细胞。EPA也是PPARγ的配体，并已被证明可降低单核细胞中LPS诱导的NF-κB激活。尽管NF-κB只是炎症反应中涉及的转录因子和信号通路之一，但该通路可能与当前IL-27浓度的观察结果有关。Th17细胞分化依赖于IL-23，在本研究中，SLE患者和HC来源的PBMC预暴露于EPA并接受HgCl和LPS攻击后IL-23显著升高，这一结果出乎意料。EPA在HgCl存在时可能增强Th17细胞分化；尽管既往体外工作报告EPA和MeHg暴露后PBMC中IL-6（Th17细胞分化所需的另一种细胞因子）无显著变化。进一步的体外研究应证实这些发现。既往体外研究已调查MeHg和LCPUFA对SLE来源细胞Th1/Th2免疫应答的影响，以及iHg对健康参与者采集细胞IL-17A的影响。这是首个 examining HgCl（iHg类似物）和n-3 LCPUFA共同对SLE患者和对照分离PBMC中Th17相关细胞因子产生影响的体外研究。本研究中EPA和DHA的剂量反映低鱼类消费者一般人群中观察到的血液浓度0.1 mmol/L。此外，所用HgCl浓度相当于血液中37 μg/L，在高鱼类消费者中可达到。本研究收集了SLE用药信息，报告所有SLE患者均服用低剂量羟氯喹和泼尼松龙，推测对Th17细胞因子产生影响很小。尽管 deemed 具有活动性疾病活动度，SLE患者病情稳定，具有轻度至中度长期损害。若SLE队列中任何患者在采样前近期经历疾病 flare，结果可能会受到混杂。本研究出于安全原因使用了iHg类似物；理想情况下应使用MeHg，因为该汞species构成鱼类消费汞暴露的风险。然而，MeHg在人体内（包括淋巴系统和肝脏）被去甲基化，产生更高浓度的iHg。值得注意的是，与MeHg相比，iHg对促炎细胞因子产生的影响更大，并被假设为自身免疫炎症的主要驱动因素。LPS被用作促有丝分裂剂以刺激TLR4并 consequently 免疫应答；然而，TLR7和TLR9与SLE病理关系更密切。未来研究HgCl和n-3 LCPUFA的体外实验应考虑靶向TLR7和TLR9的促有丝分裂剂，如分别为R848和CpG。由于这是一项初步体外研究，未来工作还应评估更广泛的Hg和n-3 LCPUFA浓度范围、更长和多个孵育时间点以及全面的免疫表型分析。这应包括评估Th17和调节性T细胞（Treg）频率，以及额外细胞因子，如IFNγ，以进一步研究IL-27与Th1应答之间的关系，以及IL-10作为Treg相关免疫调节的标志物。本体外研究报告，HgCl暴露后SLE患者来源细胞与健康对照之间Th17相关细胞因子产生无统计学显著性差异。尽管需要进一步研究，但这些结果确实提示HgCl暴露不会对Th17通路产生不良影响。虽然本研究识别了EPA对SLE患者来源PBMC中IL-27产生的更强抗炎作用，但由于IL-27对免疫系统表现出促炎/抗炎双重效应，需要进一步研究以阐明IL-27的作用。