《Journal of Inflammation Research》：Integrated Transcriptomic Analysis and Experimental Validation Identify ATF3 as a Mesangial Cell-Associated Candidate Regulator in IgA Nephropathy
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背景 IgA肾病（IgAN）是一种免疫介导的肾小球疾病，以系膜增生、炎症、细胞外基质（ECM）蓄积和进行性肾损伤为特征。本研究旨在识别IgAN相关基因，并评估激活转录因子3（ATF3）与系膜细胞活化的相关性。方法 整合公共批量转录组数据集用于差异表达、共表达网
背景 IgA肾病（IgAN）是一种免疫介导的肾小球疾病，以系膜增生、炎症、细胞外基质（ECM）蓄积和进行性肾损伤为特征。本研究旨在识别IgAN相关基因，并评估激活转录因子3（ATF3）与系膜细胞活化的相关性。方法 整合公共批量转录组数据集用于差异表达、共表达网络、机器学习和免疫浸润分析。采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）、系膜细胞特异性高维加权基因共表达网络分析（hdWGCNA）和单细胞调控网络推断（SCENIC）评估细胞类型特异性表达和调控活性。进一步使用Nephroseq和聚合IgA1（aIgA1）刺激的人系膜细胞（HMC）模型结合ATF3敲低评估上述发现。结果 整合分析识别47个共享差异表达基因（DEGs）和一个在IgAN中表达降低的12基因候选集。ATF3被优先确定为系膜细胞相关候选因子，并在所分析的单细胞数据集中显示表达和调控子（regulon）活性降低。Nephroseq分析显示IgAN相关肾脏病样本中肾小球ATF3表达较低；ATF3表达与估算肾小球滤过率（eGFR）正相关，与血清肌酐和蛋白尿负相关。聚合IgA1降低人系膜细胞中ATF3表达，而ATF3敲低进一步增加炎症细胞因子表达和增殖活性。结论 ATF3表达降低与IgAN相关系膜细胞活化相关。ATF3可能是系膜细胞相关候选调控因子，值得进一步机制和临床验证。关键词：IgA肾病；ATF3；系膜细胞；批量转录组学；单细胞RNA测序。
IgA肾病（IgAN）是最常见的原发性肾小球肾炎，也是终末期肾病（ESRD）的重要原因。其病理特征包括含IgA的免疫复合物在肾小球沉积，继而系膜细胞活化、炎症反应、细胞外基质（ECM）蓄积和进行性肾损伤。多hit假说为理解IgAN发病提供了框架，但免疫复合物沉积如何连接持续系膜损伤和疾病进展，其分子机制仍未完全明确。系膜细胞被认为是疾病进展的中心效应细胞，沉积后可发生异常活化，表现为增殖增加、炎症介质释放和ECM蓄积。批量转录组（bulk transcriptomics）可揭示肾组织全局分子改变，但肾活检标本含多种固有肾脏细胞和浸润免疫细胞，批量信号可能掩盖细胞类型特异性转录变化；单细胞RNA测序（scRNA-seq）可提供细胞类型分辨。ATF3（activating transcription factor 3，激活转录因子3）是即早应激反应转录因子，参与炎症、组织损伤和细胞适应，作用具有背景依赖性；其在系膜细胞生物学中的直接实验证据有限。既往转录组和机器学习研究将ATF3列为下调候选生物标志物或枢纽基因，肾小球空间转录组显示IgAN肾小球ATF3一致下调，但系膜细胞特异性调控活性和功能相关性仍不清楚。因此，研究人员整合多个公共批量转录组数据集与scRNA-seq，筛选IgAN相关分子调控因子，并评估ATF3与系膜细胞活化的相关性。研究结论为ATF3表达降低与IgAN相关系膜细胞活化相关，ATF3可能是系膜细胞相关候选调控因子，值得进一步机制和临床验证；其意义在于为IgAN提供候选分子标志和机制线索，并提示ATF3可能补充MEST-C组织学评估的分子信息，但仍需前瞻性大队列验证。关键技术方法：研究人员使用四个公共批量转录组数据集GSE115857、GSE35487、GSE93798和GSE37460，以及单细胞数据集GSE171314（质控后3例样本、3378个细胞：2例IgAN、1例对照）；采用ComBat批次校正、limma差异表达、WGCNA、机器学习（高斯朴素贝叶斯、支持向量机、k近邻、随机森林和XGBoost；GSE93798按7:3分为训练和内部验证，外部验证为GSE37460、GSE115857和GSE35487）、SHAP、CIBERSORT、JASPAR调控网络、FGSEA、Scanpy/Harmony/Leiden聚类、hdWGCNA和pySCENIC；以Nephroseq v5作外部临床相关验证；在人系膜细胞（HMC）中建立聚合IgA1（aIgA1）刺激模型并用ATF3 shRNA敲低，行qRT-PCR、Western blot、CCK-8、EdU、Ki67免疫荧光和长期活细胞成像。HMC购自MeisenCTCC。
研究结果：1. 整合转录组分析揭示IgA肾病核心DEGs：通过四个GEO数据集整合分析，PCA显示IgAN与对照分离，识别47个共享DEGs（43个下调、4个上调），热图可区分IgAN与对照；下调基因包括ATF3、GDF15、FOSB、EGR1和ZFP36，上调基因包括LUM、HBB、TYROBP和COL1A2；下调基因富集于p38 MAPK级联、ERK1/2、TNF-α/NF-κB、TGF-β和AP-1相关通路，上调基因富集于TGF-β1产生、胶原纤维形成、活性氧代谢、上皮-间质转化（EMT）和ECM重塑。
2. 共表达网络构建与IgAN相关模块识别：通过WGCNA（加权基因共表达网络分析）以β=3构建网络并识别25个模块，多个模块与IgAN状态相关；IgAN相关模块主要富集免疫炎症、补体激活、ECM组织、胶原相关和肾小球相关通路，对照相关模块富集凋亡调节和代谢过程；WGCNA拓扑重叠矩阵（TOM）与蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络呈正相关（r=0.180，P=0.001），支持模块生物学可信度，并将与疾病负相关的red模块优先用于后续分析。
3. 基于机器学习的特征解释和多层整合识别IgAN核心候选基因：通过五种机器学习模型进行特征优先排序，外部验证表现变异较大，朴素贝叶斯模型外部AUC较一致且平均外部MCC最高，故保留用于特征解释，但研究将其视为特征优先工具而非临床诊断模型；SHAP分析显示grp52_pc1贡献最高，低grp52_pc1值关联IgAN相关模型输出，其基因载荷包括FOSB、ZFP36、JUNB、EGR1、KLF4、JUN、DUSP1、ATF3、FOS和GDF15等即早/应激反应基因；grp52_pc1在多个队列中IgAN低于对照；与DEGs和WGCNA模块基因多层交集识别12个在IgAN中表达降低的核心候选基因（FOSB、FOS、ATF3、JUN、JUNB、KLF4、EGR1、GDF15、DUSP1、ZFP36、CXCL2、CYP27B1），这些基因表达协调并富集MAPK级联、髓系白细胞分化迁移、TGF-β受体信号、内质网应激、氧化应激和趋化因子产生等过程。
4. 单细胞分析识别ATF3为系膜细胞相关候选基因：通过GSE171314单细胞数据分析，质控后保留3例样本、3378个细胞，UMAP显示整合良好，Leiden分辨率0.50用于聚类，注释出近端小管、Henle环、足细胞、内皮、主/远端小管、闰细胞、系膜细胞、平滑肌、集合管、成纤维和单核/巨噬细胞等；细胞组成分析提示IgAN中系膜细胞相对富集及部分小管、基质和免疫细胞变化，但因样本有限仅作探索性证据；12个核心基因呈细胞类型依赖表达，系膜细胞差异表达分析显示疾病相关转录重塑，富集细胞迁移、形态发生调节、金属离子稳态和应激反应；系膜细胞下调基因与12个核心基因交集识别ATF3为共享候选。
5. 系膜细胞特异性hdWGCNA和SCENIC分析支持ATF3相关调控活性降低：通过系膜细胞hdWGCNA（β=18）识别多个模块，模块活性呈细胞类型和疾病相关变化；差异变化模块与疾病相关模块交集得到lightgreen、darkgreen和darkred模块，富集线粒体翻译与表达、核糖核蛋白复合物生物发生、转录调控和应激适应；候选模块基因与系膜细胞上调基因无重叠，而与系膜细胞下调基因重叠包括ATF3和RPL37A；SCENIC分析显示系膜细胞中ATF3调控子活性降低，而CREB5、GATA2、SOX4、KLF4、REL和JUN活性升高；ATF3候选靶网络富集未折叠蛋白反应（UPR）、细胞因子刺激、TGF-β受体信号、NF-κB相关转录调控、MAPK级联和细胞因子产生。
6. 外部验证和aIgA1刺激系膜细胞模型确认IgAN相关条件下ATF3表达降低：通过Nephroseq验证，IgAN患者肾小球ATF3表达低于健康对照；肾小球ATF3表达与eGFR正相关（n=10，r=0.6601，P=0.0378），与血清肌酐负相关（n=22，r=?0.6287，P=0.0017），与24 h蛋白尿负相关（n=7，r=?0.8798，P=0.0090），但样本量有限且变异，相关结果应视为探索性；在HMC中基于预实验CCK-8选择25 μg/mL aIgA1，长期活细胞成像显示aIgA1增加细胞融合度，qRT-PCR显示ATF3 mRNA降低而IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA升高，Western blot显示ATF3蛋白降低而PCNA和Cyclin D1升高。
7. ATF3敲低增强aIgA1诱导的体外炎症和增殖反应：通过慢病毒转导优化，选择MOI=50，qRT-PCR和Western blot确认ATF3敲低有效并选择sh3构建；在aIgA1处理的HMC中，Ki67免疫荧光和EdU掺入显示aIgA1增加阳性核比例，ATF3敲低较aIgA1+空载体进一步增加Ki67和EdU阳性；长期活细胞成像显示aIgA1+ATF3 shRNA组细胞融合度轨迹更高；Western blot显示ATF3敲低进一步增加PCNA和Cyclin D1；qRT-PCR显示ATF3敲低进一步增加IL-6和TNF-α表达，IL-1β呈上升趋势但无统计学意义。结果提示ATF3敲低增强aIgA1诱导的人系膜细胞炎症活化和增殖反应。
讨论部分总结：本研究通过差异表达、WGCNA、机器学习特征解释和多层整合优先识别12个IgAN中表达降低的核心候选基因，并因ATF3在批量转录组、系膜细胞下调基因、系膜细胞hdWGCNA模块和SCENIC调控子活性层面均获支持而优先选择ATF3。Park et al的IgAN肾小球空间转录组显示ATF3及EGR1、DUSP1、FOS、JUNB、NR4A1、RHOB和ZFP36等即早反应基因一致下调，与本研究结果一致。ATF3为即早转录因子和ATF/CREB家族成员，作用具有背景依赖性和细胞类型依赖性，常抑制病理性增殖；Chen et al报道Salvia miltiorrhiza来源ATF3诱导剂ST32da可恢复ATF3表达并减轻小鼠肥胖相关糖尿病肾病，ATF3缺乏加重肾脏炎症和纤维化，ATF3诱导可通过与HDAC2相互作用抑制NF-κB依赖性炎症基因表达，但不同疾病起始机制不同。本研究的aIgA1-HMC功能验证仅包含ATF3敲低，支持功能关联但未完全建立机制通路，未来需ATF3过表达或救援实验。Nephroseq显示肾小球ATF3表达与肾功能相关临床参数相关，但肾小球ATF3评估依赖肾活检；ATF3可能补充MEST-C组织学评估的分子信息，但需更大独立队列前瞻性验证。AlphaFold 3等结构引导计算方法未来可用于建模ATF3-DNA和ATF3-蛋白相互作用并筛选候选分子，但需生化结合、定点突变、救援实验和疾病相关模型验证。局限性包括平台差异、活检组成和队列特征导致残余异质性，外部队列组间不平衡（尤其GSE115857和GSE35487对照样本较少），单细胞样本有限，机器学习框架用于特征优先而非临床诊断，aIgA1-HMC模型仅部分反映IgAN复杂肾脏微环境，且仍需救援实验、ATF3过表达、直接下游靶点验证和体内研究。研究结论翻译：本研究识别ATF3为在IgAN相关条件下表达降低的系膜细胞相关候选调控因子。ATF3表达降低与系膜细胞炎症活化和增殖增强相关。这些发现将ATF3确定为IgA肾病中系膜细胞相关候选调控因子，并为进一步机制和临床研究提供基础。
