《Diagnostics》：Overt and Occult Hepatitis B in Hemodialysis Patients: Insights from High-Sensitivity Testing and Genetic Analysis
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**背景/目的**：隐匿性乙型肝炎感染（OBI）仍是诊断难题，在血液透析（HD）患者中尤为突出，此类患者因免疫功能紊乱及反复暴露而易于感染HBV。**方法**：研究人员采用靶向S基因和X基因的高灵敏度巢式实时PCR，评估俄罗斯圣彼得堡874例HD患者中OBI的
**背景/目的**：隐匿性乙型肝炎感染（OBI）仍是诊断难题，在血液透析（HD）患者中尤为突出，此类患者因免疫功能紊乱及反复暴露而易于感染HBV。**方法**：研究人员采用靶向S基因和X基因的高灵敏度巢式实时PCR，评估俄罗斯圣彼得堡874例HD患者中OBI的流行率及分子特征。**结果**：32/874例（3.7%）检出HBV DNA，其中显性慢性乙型肝炎（CHB）占2.1%（18/874），OBI占1.6%（14/874）。基因型D占优势（93.8%），包括亚基因型D2（56.3%）、D1（25.0%）和D3（12.5%）。OBI患者病毒载量低（6.0–148.3 IU/mL），而CHB患者呈高病毒血症（7843–64,870,000 IU/mL）。免疫逃逸突变在OBI中（92.9%）显著高于CHB（16.7%；p < 0.0001），以A128V最常见（31.3%）。核心区突变几乎普遍存在（93.7%）。在无既往抗病毒治疗史的病例中检出耐药突变者占6.3%。血清学阴性感染（即抗-HBc IgG和抗-HBs IgG均阴性）常见，占CHB的77.8%和OBI的14.3%。抗-HBc流行率随透析龄增加而升高（3.8%至43.1%，p < 0.0001），而抗-HBs随年龄增长而下降（rs = ?0.85，p = 0.0001）。**结论**：本队列中OBI影响1.6%的HD患者，免疫逃逸突变是隐匿表型的关键分子驱动因素。上述发现提示，可能有必要考虑在HD患者中开展HBV DNA筛查，因为仅凭血清学结果不足以排除隐匿性感染。
**一、研究背景与科学问题**
乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球慢性肝病、肝硬化及肝细胞癌的主要病因之一。隐匿性乙型肝炎感染（occult hepatitis B infection，OBI）是其中诊断尤为困难且常被忽视的感染形式，其定义为：标准血清学方法检测乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阴性，但肝脏和/或血清中存在具有复制能力的HBV DNA，伴或不伴针对HBV核心抗原或表面抗原的抗体（anti-HBc和/或anti-HBs）。约20%的OBI病例对所有常规HBV标志物均呈血清学阴性，从而在常规筛查中"隐形"。OBI并非良性状态，可促进肝纤维化进展、维持HBV的促癌特性并导致肝细胞癌；在免疫抑制状态下可再激活，临床谱从转氨酶无症状升高至急性肝炎、肝衰竭和暴发性肝炎；同时存在经输血、透析操作和器官移植传播的潜在风险。
维持性血液透析（hemodialysis，HD）患者是显性和隐匿性HBV感染的特殊脆弱人群，其风险因素包括反复血管通路操作、共用透析设备、频繁输血、感染控制措施不完善以及尿毒症相关免疫功能障碍。HD患者感染后成为慢性HBV携带者的比例显著高于普通人群（高达60% vs. 5–10%），并与肝细胞癌及总体死亡率升高相关。已报道的HD患者OBI流行率在不同地理区域差异极大（0%–58%），取决于HBV地方性流行程度、样本量和所用分子方法的灵敏度。因此，准确识别该人群中的OBI不仅是流行病学问题，更是临床管理和移植安全的关键环节。
OBI的发生机制具有异质性：部分源于cccDNA表观遗传沉默或宿主免疫介导的病毒基因表达抑制，导致HBsAg产生低或不可测；另一部分源于S基因突变损害HBsAg检测或分泌。依据机制和病毒复制水平，OBI可分为"真性"OBI（病毒载量低或不可测，通常低于200 IU/mL）与"假性"OBI（因突变致HBsAg不可测但病毒复制超过200 IU/mL，类似显性感染）；S基因突变并非"假性"OBI所独有，在真性OBI中亦常见。真性OBI的病毒载量常低于多数商品化PCR方法的检测下限。超灵敏定量HBsAg检测（检测下限可低至0.005 IU/mL）虽可发现常规方法漏检的OBI，但其灵敏度仍不足以在所有情况下替代HBV DNA检测。此外，S基因突变——尤其是含免疫优势"a"决定簇的主要亲水区（major hydrophilic region，MHR）内的突变——可损害免疫学方法对HBsAg的检测并降低单靶标PCR的扩增效率。在HD患者OBI中已发现S蛋白主要亲水环（MHL，SHBs aa 100–165）"a"决定簇内的特定突变、SHBs蛋白内环（aa 27–79）及C端区域（aa 170–226）的突变，跨膜域突变亦与OBI发生相关，甚至使多数血清学方法无法检出HBsAg的经典免疫逃逸突变G145R也见于HD患者；聚合酶区、核心区和X区突变可共存并进一步增加分子检测的复杂性。
为克服上述诊断局限，国际共识（2019年Taormina专家会议）推荐采用高灵敏核酸扩增技术，理想情况下为靶向至少两个独立基因组区域的巢式PCR，以可靠检出OBI。双病毒基因靶标可显著降低因单引物结合位点突变所致假阴性风险；检出OBI分离株后的基因分型和突变分析可为透析中心HBV分子流行病学、疫苗策略及免疫逃逸和耐药风险评估提供关键信息。从感染控制角度，显性与隐匿性感染的区分至关重要：HBsAg阳性（显性感染）患者通常经标准血清学筛查识别并在专用隔离间或专用机器透析，因此涵盖显性与隐匿性感染的全面分子筛查对个体管理和整个透析单元安全均属必要。基于此，本研究旨在评估高灵敏度巢式实时PCR检测HBV DNA的诊断价值，明确接受HD治疗患者中的OBI，并确定不同表现（显性、隐匿性）分离株的遗传特征（基因型、突变）。
**二、主要关键技术方法**
研究纳入俄罗斯圣彼得堡接受维持性透析至少3个月的874例成年患者（男545例、女329例；年龄18–86岁，平均59.06岁），采集血浆样本。关键技术包括：采用超速离心（24,000×g，4 °C，1 h）预浓缩病毒以提高低病毒载量样本检出率；以酶联免疫吸附试验（ELISA）定性检测HBsAg、anti-HBs IgG和anti-HBc IgG（HBsAg分析灵敏度0.01 IU/mL）；采用磁珠法核酸提取，初筛自200 μL血浆提取，结果不确定时自500 μL重复提取，定量与测序样本自≥5 mL血浆提取，每批设阴性对照；以商品化实时PCR试剂盒（分析灵敏度100 IU/mL）初筛，继而采用针对HBsAg阴性样本优化的自制高灵敏巢式实时PCR（自200 μL血浆检测下限5 IU/mL），第一轮以覆盖近全长HBV基因组的外引物扩增，第二轮在单管内多重实时PCR同时靶向S基因（FAM通道）与X基因（ROX通道），并以人HPRT基因（Cy5通道）作为内参，阳性判定要求两个病毒通道均出现Ct值且内参Ct < 38，OBI定义为同一血浆样本两份独立提取物在至少两次独立PCR中检出HBV DNA且HBsAg阴性；阳性样本以商品化试剂盒行半定量病毒载量测定；以覆盖全基因组的重叠片段行Sanger测序，序列经BLAST比对、MUSCLE比对及邻接法系统发育分析（bootstrap 1000次）确定基因型/亚基因型，并检索HBVdb与Genafor数据库进行突变分析；统计分析采用Clopper–Pearson精确区间、Fisher精确检验或Yates校正卡方检验及Spearman秩相关。
**三、研究结果**
3.1 按性别和年龄分层的血清学标志物及血清学模式流行率：全队列HBsAg流行率为2.06%，anti-HBs IgG和anti-HBc IgG分别为76.54%和28.95%；最常见的血清学模式为单纯anti-HBs IgG（53.2%），其次为anti-HBc IgG合并anti-HBs IgG（22.88%），"仅anti-HBc"模式占5.61%，构成HBsAg筛查无法识别的既往感染证据人群。男性anti-HBs IgG（80.18% vs. 70.52%，p = 0.0014）和anti-HBc IgG（33.94% vs. 20.67%，p < 0.0001）流行率显著高于女性，联合模式亦以男性更常见（27.16% vs. 15.81%，p = 0.0002，OR = 1.99）。年龄与anti-HBs IgG流行率呈显著负相关（rs = ?0.85，p = 0.0001），与anti-HBc IgG呈显著正相关（rs = 0.8，p = 0.0003），HBsAg无显著年龄趋势。
3.2 按透析龄和基础肾病分层的血清学标志物及模式流行率：anti-HBc IgG流行率随透析龄延长而升高（<1年3.8%、1–5年20.4%、>5–10年43.1%、>10年31.0%），<1年组与>10年组比较差异显著（p < 0.0001，OR = 11.25）；anti-HBs IgG自83.3%降至69.0%（p = 0.06）。血清学模式随透析龄发生显著重组：单纯anti-HBs IgG自80.8%降至46.6%（p < 0.0001，OR = 0.20），联合模式自2.6%升至22.4%（p = 0.0004，OR = 10.9），仅anti-HBc模式自1.3%升至8.6%（1–5年与>5–10年组比较p = 0.018，OR = 2.3）。按终末期肾病（ESRD）病因四分型分层，各标志物流行率及血清学模式分布均无统计学差异。
3.3 按年龄、透析龄和肾病病因分层的病毒DNA血清流行率：874例中32例检出HBV DNA，总流行率3.7%（95% CI：2.5–5.1）；其中18例HBsAg阳性（CHB）占2.1%，14例符合OBI标准占1.6%。CHB与OBI均与性别、年龄、透析龄及ESRD病因无显著关联；<1年和>10年透析龄组未检出CHB。32例HBV DNA阳性者中，多数CHB患者（77.8%）对所有受检抗体标志物均阴性，而OBI组以单纯anti-HBs IgG最常见（50.0%）。病毒载量呈与HBsAg状态相关的双相分布：18例HBsAg阳性者载量7843–64,870,000 IU/mL，其中14例anti-HBs与anti-HBc均阴性者载量1,142,000–64,870,000 IU/mL（中位数7,965,000 IU/mL），另4例双抗体阳性者载量较低（7843–94,612 IU/mL，中位数43,117 IU/mL）；14例OBI者载量均低且不超过150 IU/mL，为6.0–148.3 IU/mL（应视为半定量估计）。
3.4 HBV基因型分布、系统发育分析及临床相关突变：全基因组序列已提交GenBank（OK998519-OK998523、PX522122-PX522148）。基因型D最常见，占30例（93.8%），分为D1（8/32，25%）、D2（18/32，56.3%）和D3（4/32，12.5%）；基因型A（A2亚型）仅2例（6.3%）。OBI在D2中检出率最高（55.6%），其次为D1（37.5%）和D3（25%），A2两例均未检出，但因置信区间宽且重叠，亚基因型间OBI流行率无统计学差异，亚基因型分布与临床及人口学参数亦无显著关联。耐药突变（drug resistance mutations，DRMs）检出2例（6.3%）：1例OBI患者携带L180M/M204V（拉米夫定、替比夫定耐药），1例CHB患者携带L180M/T184A/M204V（拉米夫定、替比夫定及恩替卡韦耐药），二者均无既往抗病毒治疗记录；因逆转录酶（RT）区与S基因重叠，RT区上述突变可能影响HBsAg抗原性。免疫逃逸突变（immune escape mutations，IEMs）总检出率50.0%（16/32），OBI组为92.9%，显著高于CHB组的16.7%（p < 0.0001），OBI患者携带IEM的比值比显著升高（OR = 65.0，95% CI：6.0–704.1）。最常见突变为A128V（31.3%），其次为R122K（15.6%）和D144E（12.5%）。前core突变检出8例（25.0%），CHB组2例（11.1%）、OBI组6例（42.9%），最常见为W28（含W28*、W28*Y、W28*W，18.8%），其次为G29D（9.4%）；W28*对应G1896A，在前core蛋白第28位产生提前终止密码子。基本核心启动子经典双突变A1762T/G1764A检出8例（25.0%），CHB组5例、OBI组3例。核心区突变检出30例（93.7%），最常见为N74V/G/T/A、N87S和I97F（各90.6%），L116I为87.5%，其余包括T12S/N、E40D、A80T/I/G和I59M/S/V等。上述各类突变频率按疾病组或透析龄分层均无统计学差异。
**四、讨论与结论**
讨论部分围绕以下方面展开：其一，本队列OBI流行率1.6%处于全球报道范围（0–58%）的低端，与低至中度地方性流行区数据一致而低于部分中东队列；血清学阴性OBI占全部OBI的14.3%，鉴于OBI例数少应谨慎解读，该差异更可能反映俄罗斯自2000年代初推行普遍疫苗接种及圣彼得堡透析中心集中化感染控制所带来的流行病学转变；基因型D（含D2、D1、D3）优势与俄罗斯及邻近地区HBV分子流行病学一致。其二，HD患者中HBsAg阳性而anti-HBc阴性的比例异常高，该模式在免疫功能正常者中罕见；因未检出anti-HBc IgM且患者来自不同透析中心、携带不同病毒变异（含不同亚基因型），不支持近期感染的推断，而ESRD患者细胞免疫功能受损（淋巴细胞增殖反应降低、T细胞功能减退、免疫衰老加速）及尿毒症相关免疫功能障碍可阻碍anti-HBc产生，故HD患者anti-HBc阴性不能作为无活动性感染的证据；"仅anti-HBc"模式提示HBsAg筛查漏检的感染证据人群，其在免疫抑制（尤其肾移植后）下存在再激活风险，且anti-HBs缺失提示体液免疫应答受损。其三，病毒载量依临床状态和血清学模式呈清晰二分：CHB患者总体高病毒血症，其中双抗体阴性者最高、双抗体阳性者较低；OBI组内按血清学模式呈梯度（仅anti-HBc者最高、双抗体阳性者居中、单纯anti-HBs IgG者较低、两例血清学阴性者最低），提示残余血清学反应性与残余病毒血症水平相关，与既往报道OBI载量罕超200 IU/mL的文献一致。其四，血清学标志物流行率的性别差异可能与男性高危行为较多或性激素影响免疫应答有关，但DNA阳性例数有限需谨慎解读；anti-HBc流行率随透析龄增加支持透析本身为HBV获得的主要风险因素，单纯anti-HBs IgG模式的同步下降支持长期透析患者免疫衰老的概念；透析龄与OBI流行率无显著关联可能与OBI例数有限及低病毒载量常低于检测限有关。其五，OBI中免疫逃逸突变显著富集提供了表面蛋白突变（尤其MHR "a"决定簇aa 124–147内）通过损害HBsAg检测促成隐匿表型的分子证据，该关联在HD患者中尤为成立，因病毒遗传逃逸与尿毒症相关免疫抑制在此汇合；最常见A128V见于全部患者的31.3%和OBI的50%，R122K、D144E、S143P/L亦常见，均位于"a"决定簇内或邻近；经典免疫逃逸突变G145R仅见于1例OBI（3.1%，载量43.7 IU/mL），提示其他突变对俄罗斯HD人群OBI致病可能更具相关性；部分基因型/亚型相关替换亦被报道损害HBsAg检测和anti-HBs结合，故保留为功能性逃逸突变，如A128V为D2亚型共识残基但被描述为免疫逃逸，R122K（决定d/y血清型）和T127P（D2特征）亦损害HBsAg识别并与疫苗逃逸相关；M133S突变体经内质网应激和线粒体自噬损害HBsAg分泌的机制框架可能适用于其他改变构象表位的"a"决定簇突变。其六，核心区突变几乎见于所有患者，以N74V/G/T/A、N87S、I97F和L116I为主，可能通过改变核心蛋白（HBcAg）T细胞表位影响衣壳稳定性与免疫逃逸，其在各临床状态下的近乎普遍存在提示可能与HD患者慢性HBV感染相关；前core突变在OBI中更常见，W28终止密码子突变阻止HBeAg表达，与病毒复制降低和免疫逃逸相关，HBeAg作为耐受原诱导T细胞耐受，其缺失可能促进部分患者免疫清除而致OBI特征性的低水平持续感染，但在免疫抑制的HD患者中HBeAg缺失可能不致清除而致逃逸免疫检测的低水平复制状态；基本核心启动子双突变在CHB与OBI中比例相近，与HBeAg合成减少、病毒复制增加、肝病更重及肝细胞癌风险升高相关。其七，两例无核苷（酸）类似物治疗记录患者检出耐药突变，可能于透析前或透析期间经水平传播获得；RT与S基因重叠使一方突变可影响另一方，S基因免疫压力甚至可能在无抗病毒治疗下选择耐药RT变异，凸显透析人群耐药监测的必要性。局限性包括：横断面设计无法评估时间变化或病毒动力学；缺乏肝活检（OBI诊断金标准）故未能确认肝内HBV DNA；OBI例数（n = 14）限制亚组分析效能；OBI病毒载量常低于商品化试剂盒定量下限（15 IU/mL），仅作半定量估计；自制方法检测下限5 IU/mL以下的样本无法检出，但不影响以两轮独立提取扩增确认OBI的主要定性结论；仅检测HBsAg、anti-HBc和anti-HBs IgG，故"血清学阴性"仅指此三项标志物缺失；低于常规方法分析灵敏度0.01 IU/mL的HBsAg无法检出；单地区研究结果外推性有限；HBV DNA仅单次检测，不能排除低于检测限的短暂病毒血症。
结论部分译文：本研究评估了俄罗斯圣彼得堡874例血液透析患者队列中HBV感染的流行率，并对32例可检出HBV DNA者进行分子分析。OBI检出率为1.6%，显性CHB为2.1%，基因型D占优势（93.8%）。免疫逃逸突变在OBI患者中的流行率显著高于CHB患者。血清学阴性OBI病例表明，仅凭血清学检测不足以识别全部HBV感染的血液透析患者。病毒载量随血清学模式呈梯度变化，提示血清学状态与残余病毒血症之间存在关联。核心区突变的近乎普遍存在提示其可能与血液透析患者的慢性HBV感染相关。耐药突变的存在及HBV暴露随透析龄延长而逐渐增加，凸显分子监测的必要性。上述发现提示，无论血清学模式如何，可能有必要考虑在HD患者中开展HBV DNA筛查；然而，该策略的临床结局、传播风险及成本效益仍有待前瞻性研究评估。
