《Cell Reports》：Locus coeruleus noradrenergic neurons have diverse activity patterns across species and biological context
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蓝斑（LC）脑干细胞群在脊椎动物中进化保守，通过两种（据推测相互独立的）自发放电模式同时影响心智（认知）与躯体（心肺、代谢及免疫功能）。然而，由于单个研究的样本量固有局限，自发LC放电频率与模式在不同物种间的同质程度从未得到评估。为弥补这一不足，研究人员汇总了
蓝斑（LC）脑干细胞群在脊椎动物中进化保守，通过两种（据推测相互独立的）自发放电模式同时影响心智（认知）与躯体（心肺、代谢及免疫功能）。然而，由于单个研究的样本量固有局限，自发LC放电频率与模式在不同物种间的同质程度从未得到评估。为弥补这一不足，研究人员汇总了来自20个实验室的跨物种数据，结果显示放电频率因物种而异，并受性别、年龄及体外或体内制备类型调控。与主流双模式放电图式相反，研究人员观察到放电模式分布于一个低维流形（low-dimensional manifold）之上，其亚区富集了特定生物学因素及神经退行性疾病模型。研究结果表明，这一祖先性脊椎动物神经调质系统存在相当大的多样性。
**研究背景与问题** 蓝斑（locus coeruleus，LC）是脑干去甲肾上腺素能细胞群，其向中枢神经系统全脑的投射在脊椎动物系统发生树上得以保留，其核心功能——响应环境变化动员心肺、代谢及感觉-运动-认知资源——亦在脊椎动物中保守。该功能被认为由两种活动模式（紧张性tonic或相位性phasic）实现。相位性活动最常被归因于刺激诱发放电，但自发产生的相位性爆发同样存在，并对皮层状态具有与刺激诱发相位性活动相似的神经调质效应，且自发相位性活动出现于幼鼠衔回等自然母性行为中，不能归因于感觉刺激、运动反应或动作努力。然而，自发相位性爆发尚未被详细描述。由于当前对自发LC相位性爆发的定义源自Grace与Bunney 1984年对多巴胺能神经元的研究，该领域缺乏数据驱动的自发LC相位性爆发定义。尽管缺乏此信息，紧张性-相位性双模式术语已被广泛应用于人类神经影像学、认知心理学研究以及认知与学习的计算模型。基于LC结构与功能的进化保守性，研究人员假设LC神经元的放电模式在脊椎动物中保守，以履行基本功能作用。迄今为止，由于单个研究样本量小，该假设从未被检验：脑片记录通常仅记录单个神经元，在麻醉或清醒动物中，细胞外记录仅能获取一或两个LC神经元，理论上可同时记录多个神经元（“单单位”）但受心脏、呼吸及脊柱运动所致电极-组织界面物理不稳定性的影响，在脑干中产出极为有限。LC经由升行全脑投射参与注意缺陷多动障碍、精神分裂症及神经退行性疾病中的认知缺陷，以及创伤后应激障碍、焦虑障碍的心理与躯体症状和阿片戒断症状；经由下行投射至自主神经系统与脊髓，影响外周镇痛、心血管疾病、免疫功能障碍、代谢紊乱与肥胖。LC与如此广泛的人类健康与疾病状况的相关性，凸显了确认或否证LC活动是否随物种或性别、年龄、实验制备等因素变化的重要性。为此，研究人员汇总了20个实验室采集的LC神经元自发产生的锋电位序列（spike trains），数据包括雌雄小鼠与大鼠，以及雄性猕猴（Macaca mulatta，非人灵长类NHP）；动物涵盖相对年轻（青春期）至成年及晚年；锋电位放电记录于组织切片（细胞内）、多种麻醉下的完整动物或清醒状态；部分LC神经元或动物经遗传修饰以用于光遗传学操作（光遗传刺激期间的记录未纳入数据集，但遗传修饰作为可能影响放电频率的因素予以考虑）；部分小鼠经药理学操作或培育为表达疾病特异性基因型。提供细胞外记录的实验室被要求仅纳入单单位（下称“神经元”）。数据贡献还要求至少一种验证所记录神经元为去甲肾上腺素能LC细胞的方法，符合标准验证指南，可采用以下任一或任意组合：组织学、对感觉刺激的双相反应、可乐定诱发的放电抑制和/或光标记（optotagging）。为在各实验室间应用相似标准定义单单位，研究人员对2,944个神经元进行了质量控制筛查，分别获得1,855个（用于放电频率分析）和1,708个（用于放电模式分析）神经元。研究目标是比较神经元活动水平（放电频率）并描述跨物种及一系列内在与外在因素的紧张性与相位性放电模式。
**主要技术方法** 研究汇总20个实验室跨物种LC单单位记录（小鼠、大鼠及雄性猕猴，涵盖切片、多种麻醉与清醒状态），采用负二项回归边际模型（广义估计方程算法，SAS PROC GENMOD）分析放电频率的独立效应及交互效应，并以效应量及95%置信区间（CI）辅助验证；采用DABEST工具箱计算效应量；对ISI分布（1 ms至100 s对数分箱）进行主成分分析（PCA）并以loess函数拟合流形；以两样本Kolmogorov-Smirnov检验比较ISI分布形状；构建返回图（return map，即Poincaré图）刻画二阶ISI动力学并人工聚类为8种类型，以卡方检验比较各因素比例。
**研究结果**
*LC放电频率在模型物种间不保守，并受脑状态与性别影响* 分析显示物种主效应显著（p < 0.0001）：小鼠神经元放电频率高于大鼠（p < 0.0001）与NHP（p = 0.0001），大鼠与NHP间无显著差异。物种效应与实验制备类型（动物状态）存在交互（p = 0.001）：小鼠LC在所测试的全部麻醉下及体外脑片记录中均较大鼠更活跃；但在清醒状态，小鼠LC神经元较大鼠（p = 0.0036）及NHP（p = 0.0491）更不活跃。物种效应亦与性别交互（p = 0.0103）：小鼠高于大鼠和NHP的现象特异见于雄性（效应量分别为1.09与1.07 spikes/s），雌性中小鼠与大鼠无物种差异（无雌性NHP数据）。
*性别在大鼠与小鼠中以相反方向影响LC放电频率* 性别主效应显著（p < 0.0001），雌性LC较雄性更活跃（效应量0.4 spikes/s）；性别与脑状态存在独立交互（p = 0.0044）：雌性LC仅在水合氯醛麻醉（p = 0.031）或脑片记录（p = 0.024）中更活跃，而清醒状态下雌性较雄性更不活跃（p = 0.004）。性别效应亦依赖物种（p = 0.0103）：大鼠中雌性LC较雄性更活跃（p < 0.0001），小鼠中则相反（p = 0.034）。
*清醒状态下大鼠放电频率升高而小鼠降低* 实验制备主效应显著（p < 0.0001）：乌拉坦麻醉下放电频率较水合氯醛（p < 0.0001）、异氟烷（p = 0.006）及脑片（p = 0.003）低约0.3~0.47 spikes/s；总体而言清醒状态放电频率与麻醉及去传入脑片记录相似。但制备与物种存在独立交互（p = 0.001）：大鼠清醒时LC较乌拉坦麻醉（p = 0.034）或脑片（p = 0.019）更活跃；小鼠则相反，清醒时放电频率低于水合氯醛（p < 0.0001）、异氟烷（p = 0.0005）、乌拉坦（p = 0.001）及脑片（p < 0.0001）记录。
*雌性LC在清醒状态下放电频率受抑制* 制备与性别存在独立交互（p = 0.004）：雄性除不同麻醉类型间小差异外，麻醉、切片与清醒状态活动相似；雌性清醒时放电频率较脑片及多数麻醉低，效应量达0.96~2.49 spikes/s，即清醒雌性LC放电频率较去传入脑片或麻醉下大幅抑制（约≥1 spikes/s）。
*用于光遗传与化学遗传实验的遗传修饰可能不明显影响LC放电频率* 遗传操作类型对放电频率有显著效应（p < 0.001）：野生型动物放电频率高于VGAT-Cre动物（p = 0.0007），但与DBH-Cre或TH-Cre动物无差异；该效应不依赖年龄或性别。由于VGAT-Cre与DBH-Cre数据来自小鼠、TH-Cre数据来自大鼠，无法评估其与状态或物种的交互。VGAT-Cre小鼠仅贡献单一实验室的少量神经元，需进一步研究。
*LC随衰老逐渐变得更活跃* 年龄主效应显著（p = 0.006）：青春期放电频率低于成年（p = 0.0002）与老年（p < 0.0001），成年低于老年（p = 0.035）；年龄与任何其他因素均无交互，提示老化过程中LC活动的逐渐升高不依赖基因型或性别。
*除非退化特异性靶向LC神经元，神经退行性疾病模型中LC放电频率不受影响* 疾病模型类型主效应显著（p < 0.0001）：经DSP-4处理动物放电频率高于野生型（p = 0.0249），其余模型（表达APP/PS1突变的TgF344-AD大鼠、6-OHDA偏侧帕金森模型、6-OHDA联合3周L-DOPA的异动症模型）与对照无差异。该效应不依赖性别或年龄；与物种或脑状态的交互不可估计。
*LC活动跨越多样放电模式谱，落于——但受限于——一个低维流形* 传统上放电模式被标记为“紧张性”或“相位性”：紧张性放电为不规则锋电位，ISI长达数百毫秒（放电频率低于约6 spikes/s），相位性模式由50~100 ms窗口内2~3个锋电位及相应短（<80 ms）ISI构成。研究人员对1,708个神经元的对数分箱ISI分布（1 ms至100 s）进行PCA，前三个主成分解释59.56%方差（PC4降至7.89%，其后均<5%）。结果并未出现对应两类离散簇的两个点群，而是沿低维流形分布，具有沿第三主成分零轴的致密中央“核心”区及正负第三主成分轴散布的“周缘”区。周缘区各区域的ISI分布均值大多为0.3~1.0 s（3.3至1.0 spikes/s），分布均较窄因而定性上呈节律性；核心区神经元ISI变异性较大、相对较不节律。部分模式（如PC2与PC3均高度正值）未出现在流形上，提示某些活动动力学可能不被允许或未在本数据集中表达。
*考虑脑状态、物种、年龄与基因型时，放电模式可占据流形的特定区域* 脑片放电模式位于流形周缘，清醒个体放电模式集中于核心，麻醉下放电模式散布于整个流形但避开脑片所占周缘。脑片与清醒记录的差异表现为更节律性放电（下限约100 ms），而清醒LC放电模式具有更短（低至约10 ms）及更长（长达约10 s）的ISI。两样本Kolmogorov-Smirnov检验显示清醒与脑片（KS = 0.374，p < 0.001）、清醒与麻醉（KS = 0.353，p < 0.001）ISI分布形状显著不同，清醒与麻醉相似（KS = 0.111，p = 0.549）。NHP、小鼠和大鼠均占据流形大部分区域，NHP占据核心；各物种ISI分布相似，但小鼠与NHP放电模式可能不同（KS = 0.202，p = 0.030），这可能源于NHP仅在清醒时记录。未发现性别与不同放电模式相关的证据。青春期与成年动物神经元散布于流形，老年动物神经元定位于核心一侧；成年与老年ISI直方图无显著差异（KS = 0.131，p = 0.338）；青春期神经元外观上孤立于周缘且与成年（KS = 0.394，p < 0.001）及老年（KS = 0.343，p < 0.001）ISI分布显著不同，但这可由青春期神经元仅来自脑片记录解释（体外记录通常取自年轻动物脑片）。VGAT-Cre神经元偏向流形一端且ISI尤为节律，其ISI分布与TH-Cre（KS = 0.263，p = 0.002）、DBH-Cre（KS = 0.323，p < 0.001）及Gad2-Ires-Cre（KS = 0.242，p = 0.005）显著不同；DBH-Cre较TH-Cre分布更弥散，两者ISI分布亦显著不同（KS = 0.273，p = 0.001）。结果提示仅在全脑多种神经元中表达Cre即可能改变LC神经元自发放电模式。
*LC锋电位模式的时间动力学呈现多种吸引子动力学，主要依物种、年龄、性别与遗传修饰表达* 研究人员对符合条件1,708个LC神经元计算返回图（因自动方法如PCA、方向梯度直方图分析与k均值聚类表现不佳而人工分组），识别出8种返回图模式：类型1~5（占所产生模式的62.5%及大多数神经元）显示单一刻板放电模式（即吸引子），因ISI变异性而形状不同，符合不规则紧张性基线活动的预期；类型6~8具有多个吸引子，由紧张性放电与离散相对频率的爆发交替产生。复杂多吸引子模式见于少数神经元（N = 115，6.73%），大多数神经元以类型1或2单吸引子模式放电（N = 1,249，73.13%）。因素分布分析显示：类型2几乎全为大鼠LC神经元；小鼠神经元在类型4与5中过表达；NHP在类型3中过表达；类型1与3中老年动物比例更高，青春期神经元尤常见于类型4（ISI最一致），类型2几乎全为成年神经元，且ISI变异性在青春期类型中极低、成年类型中增大、老年类型中最大；无返回图类型完全特异于某一性别，雄性神经元在类型1与7占优，类型4中雌性比例更高；类型4与5中脑片记录比例显著更高且无清醒神经元，类型2几乎全为麻醉动物，类型1与8中清醒状态比例更高；类型1、6、7以乌拉坦麻醉神经元为主且无异氟烷神经元，类型3无异氟烷神经元但水合氯醛神经元比例更高，类型2与4中异氟烷及水合氯醛神经元比例更高（75%的二阶锋电位模式在乌拉坦、水合氯醛和/或异氟烷记录神经元组成上存在差异）；类型2中异动症与帕金森病药理模型神经元比例升高而APP/PS1与DSP-4模型降低，类型1与3呈相反模式；类型2几乎全为野生型，类型3中TH-Cre比例更高，类型5与8中DBH-Cre比例更高，类型3、5、8中VGAT-Cre比例亦增加。
**讨论与结论** 讨论指出，LC是祖先性脑区，其进化保守功能被认为通过两种放电模式实现：缓慢不规则的紧张性活动或快速相位性爆发活动。与这一自发LC活动双模式概念相反，研究人员发现远多于两种的放电模式，沿低维流形分布，其时间动力学可描述为不同类型的吸引子；特定放电模式与平均活动水平在物种间均不保守。负二项回归模型控制了各因素的独立与联合效应，模型显著性检验完全得到效应量95%CI评估的支持（95%CI即83%预测区间），所有发现均由统计模型与非基于p值的方法共同支持。物种、性别、年龄与脑状态等因素的比较本质上成为跨实验室比较，因各实验室专长通常集中于单一物种与单一实验制备；但实验室间放电频率变异低，组内相关系数为0.48，提示放电频率对实验室身份的依赖程度为低至中等。讨论还考虑了电极在LC内背腹轴位置、昼夜节律（先前研究提示LC活动在昼夜周期最小/最大值间变化约1.5倍，而本研究发现如大鼠对小鼠2.26倍的更大效应量）及实验室间方法学差异对结果的潜在影响，认为实验室变异不能完全解释全部发现，强调需开展控制实验室间变异的前瞻性设计研究。研究强调自发LC活动模式应被视为异质性谱系而非以放电频率或ISI刚性阈值划分的两种模式；虽无单一爆发定义，特定研究问题仍可采用特定ISI截断；刺激诱发的相位性爆发可能具有明确的ISI截断，有待未来利用多实验室大数据确定。数据驱动的自发LC相位性爆发表征不仅对理解LC对皮层状态与行为的神经调质作用具有重要意义，也对采用双模式概念框架的人类神经影像学、认知心理学与计算神经科学研究，以及瞳孔测量（pupillometry）、光遗传或电刺激操作LC的实验具有意义；短ISI时LC轴突去极化使爆发中后续锋电位传导更快，可能影响去甲肾上腺素（NE）释放幅度及共同递质释放倾向。衰老方面，LC放电从青春期半节律性放电经成年期以不规则为主，至老年期变为更节律、更快的活动，平均放电频率随年龄逐渐升高，与人类神经影像学及小鼠脑片记录一致，但与一项先前麻醉大鼠研究不符，可能因其样本量较小；年龄相关变化可能是对啮齿类与人类随年龄自然发生的NE纤维损失的代偿性适应。在神经退行性疾病相关模型中，APP/PS1与DSP-4动物富集于类型1和3单吸引子返回图而在类型2中不足，异动症与帕金森病大鼠模型呈相反模式，提示单吸引子（而非多吸引子）动力学是神经退行性疾病相关LC改变的共有特征。研究局限性包括：许多生物学因素是单一实验室方法学的固有属性，未来联盟应使各实验室采集多物种、多年龄、双性别、多基因型与多种记录制备的数据，并规范记录时长与授时因子时间；刺激诱发时LC放电模式是否同样多样仍为开放问题；分析未控制LC内电极精确位置，背腹轴位置可能因放电频率、放电模式、神经元兴奋性与LC内连接在该轴上的变异而重要，后续研究应采用层状多电极探针依据电生理标志与LC解剖制图。结论为：利用多实验室共享数据，分析揭示了多样的神经元放电模式，可描述为低维流形，其动力学表达为吸引子；放电模式与平均放电频率均依赖物种、性别与年龄等内在生物学因素。尽管LC是脊椎动物共有的祖先性脑区，数据表明其活动并未紧密保守。LC可能是在塑造各物种神经系统的进化压力这一可变情境中整合入脊椎动物神经系统的；经由其广泛的中枢神经系统全脑连接，这一祖先性脑区可能促成感觉加工、认知功能、运动控制与行为以及心血管、免疫与代谢功能中与性别、物种和年龄相关的差异。
