活性氧响应型超分子水凝胶系统用于溶瘤腺病毒与紫杉醇在癌症治疗中的可控共递送

《Acta Biomaterialia》：ROS-responsive supramolecular hydrogel system for the controlled release of oncolytic adenovirus and paclitaxel in cancer therapy

　　

溶瘤腺病毒（oncolytic adenovirus, oAd）与紫杉醇（paclitaxel, PTX）化疗药物的协同组合在癌症治疗中具有巨大潜力，因其可增强细胞凋亡、促进癌细胞内病毒复制，并诱导强效抗肿瘤效应。然而，由于高活性氧（reactive oxygen species, ROS）肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中病毒活性的快速血液清除和失活，临床效果尚不理想。为此，研究人员开发了一种ROS响应型超分子水凝胶（mPEG-b-PCL-DPMP/α-环糊精（DPMP/α-CD hydrogel））系统，以保护oAd生物活性的同时实现紫杉醇（PTX）的持续局部共递送。利用H2DCFDA作为探针进行荧光测量评估ROS水平，确认DPMP/α-CD水凝胶显著降低了ROS水平。体内降解研究表明，该水凝胶在一周内发生明显降解。此外，封装于DPMP/α-CD水凝胶中的oAd和PTX可持续释放并保持病毒活性，在强肿瘤微环境条件下展现出癌细胞杀伤效力。在体内实验中，单次瘤内注射形成稳定的药物储库，持续超过一周，相较于裸oAd或单独PTX，在H460异种移植模型中实现了优异的肿瘤消退。组织学和生化分析证实，在所评估的条件下，所检测的主要器官未发现可观察到的组织病理学异常，血清肝肾功能损伤标志物也未升高。总之，这种载有oAd/PTX的ROS响应性屏蔽-释放型可注射超分子水凝胶平台在肿瘤微环境中下调了ROS水平并增强了抗肿瘤效应。

论文解读：ROS响应型超分子水凝胶用于溶瘤腺病毒与紫杉醇协同递送

一、研究背景与问题提出

溶瘤腺病毒（oncolytic adenovirus, oAd）作为一种选择性在肿瘤细胞内复制并裂解肿瘤细胞的基因治疗载体，在癌症治疗中展现出巨大潜力。然而，其临床应用面临两大障碍：一是病毒在体内的快速清除和免疫原性导致的短暂治疗窗口；二是肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中高浓度的活性氧（reactive oxygen species, ROS）会氧化损伤病毒核酸，导致其生物活性迅速丧失。与此同时，紫杉醇（paclitaxel, PTX）作为微管稳定剂，可通过诱导异常有丝分裂和有丝分裂滑脱等机制增强oAd介导的肿瘤细胞杀伤。因此，如何实现oAd与PTX的局部、持续且安全的共递送，同时保护oAd免受氧化应激损伤，成为提升联合治疗效果的关键科学问题。现有纳米载体如水凝胶虽具备局部递送优势，但缺乏对氧化性TME的主动调控能力。基于此，研究人员设计了一种兼具ROS清除与响应释放功能的超分子水凝胶系统，旨在解决上述瓶颈。该论文发表于《Acta Biomaterialia》。

二、关键技术方法

1. 1.
   聚合物合成与表征：通过开环聚合合成mPEG-b-PCL二嵌段共聚物，再经丙烯酸酯化及与二季戊四醇六(3-巯基丙酸酯)（DPMP）的交联反应，引入ROS响应的硫醚基团，制备ROS清除型共聚物mPEG-b-PCL-DPMP。采用¹H NMR、GPC、XRD和DSC等手段验证其化学结构与超分子组装行为。
2. 2.
   水凝胶制备与优化：将mPEG-b-PCL-DPMP与α-环糊精（α-CD）混合，通过α-CD穿入PEG链形成超分子交联网络，构建可注射水凝胶。通过倒管法和流变学测试筛选最优配方（14 wt%聚合物 + 11 wt% α-CD）。
3. 3.
   ROS清除与响应释放评价：利用H₂DCFDA荧光探针定量水凝胶对H₂O₂的清除能力；在不同H₂O₂浓度下考察oAd和PTX的释放动力学及病毒活性保持情况。
4. 4.
   体外与体内抗肿瘤实验：选用人肺癌细胞系H460、A549等进行体外细胞毒性及病毒感染性实验；在BALB/c裸鼠皮下H460异种移植瘤模型中评估单次瘤内注射的治疗效果，并通过H&E、PCNA、TUNEL及Hexon蛋白免疫组化染色分析机制。另在MC38同源小鼠模型和MDA-MB-468异种移植模型中补充验证。

三、研究结果

3.1 ROS清除聚合物的合成与初步超分子表征

成功合成了mPEG-b-PCL-DPMP共聚物。¹H NMR证实了各步中间体的结构，H₂O₂处理后观察到硫醚相邻亚甲基信号向低场移动，表明发生了氧化。XRD和DSC显示α-CD与聚合物形成了包合物，且PTX被成功包裹于基质中。细胞毒性实验表明该共聚物在正常细胞和癌细胞中均具有良好的细胞相容性。

3.2 水凝胶的优化与理化性质

通过相图确定14 wt%聚合物与11 wt% α-CD为最佳配方，该配方在室温下可控制凝胶化，适合注射。流变学测试显示储能模量G'大于损耗模量G''，呈现典型弹性凝胶行为。SEM显示水凝胶具有互连多孔结构，PTX负载未改变孔径分布。PTX和oAd的包封率分别达93.7%和97.2%。

3.3 水凝胶的体内行为

皮下注射后15分钟内即形成白色凝胶储库，表明体内快速凝胶化。IR780示踪显示荧光信号在8天内逐渐衰减，H&E染色观察到注射部位水凝胶支架逐步降解，伴随一过性粒细胞浸润但在4天内消退，证明水凝胶免疫原性低。瘤内质量回收实验进一步证实水凝胶在一周内基本降解。

3.4 水凝胶对腺病毒的持续释放

利用Transwell模型模拟ROS环境，发现裸病毒在1天后即失去感染性，而不同浓度（13%、14%、15%）的水凝胶均可持续释放具有感染活性的腺病毒长达9天。其中14 wt%配方释放的病毒GFP表达最稳定且强度最高，说明适中的网络密度有利于病毒的保护与释放平衡。

3.5 ROS清除机制与协同细胞毒性

DPMP水凝胶可在96小时内将1000 μM H₂O₂降至约160 μM，展现显著ROS清除能力。在500 μM H₂O₂条件下，oAd/Gel组的细胞杀伤效果优于裸oAd，证实水凝胶对病毒的保护作用。ROS触发硫醚氧化为砜/亚砜后增加亲水性，加速凝胶降解，使oAd释放率从57.3%提升至78.7%。PTX释放也随H₂O₂浓度升高而加速。oAd+PTX/Gel双载组在7天后表现出最强的癌细胞杀伤效果，且qPCR显示PTX共处理可提高腺病毒基因组拷贝数，提示PTX可能促进病毒扩增。

3.6 体内抗肿瘤效果增强

在H460异种移植模型中，oAd+PTX/Gel单次瘤内注射实现了最显著的肿瘤抑制效果，显著优于裸oAd、裸PTX及非响应性水凝胶对照组。所有水凝胶处理组小鼠体重稳定，表明系统毒性低。

3.7 免疫组化分析

oAd+PTX/Gel组肿瘤组织中H&E和TUNEL染色显示大面积坏死和凋亡，PCNA增殖标志物显著降低。Hexon蛋白染色表明水凝胶组病毒在肿瘤内持续存在和复制，PTX染色证实药物在局部长期滞留。

3.8 安全性分析

主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）H&E染色未见病理异常，血清肝功能指标（AST、ALT）和肾功能指标（BUN、CRE）均在正常范围内，证明该水凝胶系统具有良好的生物安全性和局部限制效应。

四、总结与结论

本研究成功构建了一种ROS响应型超分子水凝胶（mPEG-b-PCL-DPMP/α-CD），用于共包载和持续释放PTX与oAd。该水凝胶展现出卓越的ROS响应性和病毒活性保护能力，可在模拟ROS环境中持续释放具有感染活性的病毒载体。oAd+PTX双载水凝胶的抗肿瘤效果显著优于单一药物水凝胶组。微管稳定剂PTX的加入进一步促进了oAd在肿瘤细胞中的选择性复制和感染，从而增强抗肿瘤活性。结论指出，这种可注射超分子水凝胶是一种有前景的生物材料，可用于在肿瘤微环境中持续释放病毒载体和化疗药物，实现癌症的联合治疗。