百里香酚对口腔白色念珠菌抗生物膜作用的机制研究：表型与基因型水平分析

《Journal of Oral Microbiology》：Mechanism of anti-biofilm thymol activity in oral Candida albicans strains – phenotypic and genotypic level

　　

摘要专业翻译 背景：近年来，由白色念珠菌（Candida albicans）引起的浅表感染发生率持续上升。与此同时，现有抗真菌药物种类有限，促使研究者不断寻找新型抗真菌药物。 目的：本研究旨在评估百里香酚（thymol，THY）对取自血液肿瘤患者的口腔白色念珠菌（C. albicans）分离株的抗真菌活性，尤其是抗生物膜作用。 设计：研究内容包括：（1）采用肉汤微量稀释法测定THY对白色念珠菌的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最低杀菌浓度（minimum fungicidal concentration，MFC）；（2）采用相同技术结合结晶紫（crystal violet，CV）染色评估其对生物膜形成抑制和成熟生物膜减少的作用；（3）通过山梨醇（sorbitol）和麦角固醇（ergosterol）试验揭示THY与酵母细胞结构的相互作用；（4）利用光学显微镜观察其对菌丝化（filamentation）的影响；（5）通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，RT-qPCR）评估其对选定生物膜相关基因表达的影响。 结果：THY表现出良好或中等的抗念珠菌活性，且具有杀菌效应。抑制生物膜形成或清除成熟生物膜所需的浓度更高。这些结果提示THY可能对白色念珠菌的细胞膜和菌丝化过程产生影响。探索性RT-qPCR分析显示，在生物膜形成条件下，BCR1基因表达呈方向性升高（未校正p = 0.010），但经Benjamini?Hochberg校正后该结果不再具有统计学显著性（q = 0.080）。ALS3、HWP1和NRG1显示出非显著的方向性趋势，而浮游条件下未发现任何基因出现统计学显著变化。 结论：THY展现出多方向的抗念珠菌作用机制，提示其在口腔感染预防和治疗中具有潜在应用前景。

论文主体解读

一、研究背景与问题

真菌感染已成为全球重大医学问题，每年导致约1.5亿例严重真菌感染病例，死亡人数接近200万。在机会性真菌感染中，由人类微生物群中念珠菌属（Candida）酵母引起的感染最为常见，可导致浅表性、侵袭性甚至致命性念珠菌病。其中，白色念珠菌（Candida albicans）是最具医学重要性的物种，定植于30%–50%健康人群的口腔黏膜表面，且携带率随年龄增长和佩戴义齿者增加至60%。白色念珠菌约占所有念珠菌感染的75%–80%。

白色念珠菌的主要毒力因子包括黏附宿主组织的能力、生物膜（biofilm）形成、酵母相向菌丝相转变、表型转换、代谢适应、侵袭素产生和水解酶分泌等。大多数念珠菌感染与生物膜形成密切相关。这种微生物群落形成于生物表面（黏膜）或非生物表面（义齿、导管及其他植入式医疗设备），并被胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）基质所包围。生物膜结构使白色念珠菌能够抵御宿主免疫攻击并耐受更高浓度的抗真菌药物。

目前可用于治疗念珠菌感染的抗真菌药物仅有少数几类：多烯类（polyenes，如两性霉素B、制霉菌素）、唑类（azoles，如氟康唑、泊沙康唑）和棘白菌素类（echinocandins，如卡泊芬净、米卡芬净）。抗真菌药物种类匮乏、耐药性快速出现、长期使用及严重不良反应等因素，严重限制了念珠菌病的有效治疗选择。此外，真菌细胞中独特的药物靶点数量有限。这一现状促使研究者加大对新型抗真菌化合物（包括天然物质）的研究力度，以期用于替代疗法。

百里香酚（thymol，THY），又名2-异丙基-5-甲基苯酚，是一种异构酚类单萜，具有强烈气味，易溶于醇类和其他有机溶剂，但水溶性较差。它大量存在于多种植物精油中，含量可达30%–80%，如百里香属（Thymus）、香薄荷属（Satureja）等植物。THY具有广泛的生物活性，包括抗风湿、抗氧化、自由基清除、镇痛、解痉、抗炎、抗癌、防腐和抗菌等作用。美国食品药品监督管理局（FDA）认定其为一般公认安全（generally recognized as safe，GRAS）物质，可用于人类消费和食品添加剂。THY常被用于口腔卫生和牙科领域，作为漱口水、牙膏和抗菌溶液的成分。尽管THY的体外和体内抗菌活性已有报道，但其部分作用机制尚未被深入研究。

二、研究目的与设计

本研究旨在体外评估THY对来自血液系统恶性肿瘤住院患者口腔的白色念珠菌参考菌株和临床菌株的抗真菌活性，评估其抗生物膜活性及作用机制，包括与真菌细胞结构的相互作用及其对菌丝化过程的影响，并分析THY对生物膜形成相关选定基因表达的影响。

三、主要关键技术方法

研究人员采用肉汤微量稀释法（依据EUCAST和CLSI推荐标准）测定THY的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MFC）；采用结晶紫（CV）染色法结合96孔聚苯乙烯微板评估生物膜形成能力、THY对生物膜形成抑制和成熟生物膜减少的作用；通过山梨醇试验和麦角固醇试验分别探究THY对细胞壁和细胞膜的作用机制；利用光学显微镜评估THY对菌丝化过程的影响；采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析THY对8个生物膜相关基因（ALS3, CYS3, HWP1, NRG1, SAM2, TUP1, GRF10, BCR1）表达的影响。菌株来源包括2株参考菌株（ATCC 2091和ATCC 10231）及30株来自血液肿瘤住院患者口腔念珠菌病的临床分离株。

四、研究结果

（一）THY的抗真菌活性

MIC测定结果显示，THY对两株参考菌株的MIC范围为125–250 μg/mL，MFC为125–500 μg/mL，MFC/MIC比值为1–4，表明THY具有杀菌效应。对30株临床分离株，THY的MIC范围为62.5–500 μg/mL，MFC范围为125–1,000 μg/mL。其中，40%（12株）的菌株在125 μg/mL浓度下被最大程度抑制，20%（6株）在62.5 μg/mL浓度下即被抑制。按活性分级，THY对60%（18株）的临床菌株显示良好活性，对40%（12株）显示中等活性。MIC₅₀ = 125 μg/mL，MIC₉₀ = 250 μg/mL；MFC₅₀ = 250 μg/mL，MFC₉₀ = 500 μg/mL。所有临床菌株的MFC/MIC比值均≤4，证实THY对所有测试菌株均具有杀菌作用。

（二）THY对生物膜形成和成熟生物膜的影响

参考菌株具有中等生物膜形成能力；30株临床菌株中，33.3%（10株）为强生物膜产生菌，53.3%（16株）为中等，13.3%（4株）为弱。THY以浓度依赖性方式抑制和减少生物膜。对参考菌株，抑制≥50%和≥90%生物膜形成所需浓度为250–1,000 μg/mL；而减少≥50%成熟生物膜所需浓度为500 μg/mL，减少≥90%所需浓度为2,000–4,000 μg/mL。对临床菌株，抑制≥50%生物膜形成的浓度为62.5–2,000 μg/mL（最常发生于250 μg/mL，33.3%菌株），抑制≥90%的浓度为125–2,000 μg/mL（最常发生于500 μg/mL，33.3%菌株）；减少≥50%成熟生物膜的浓度为250–4,000 μg/mL（最常发生于500 μg/mL，36.7%菌株），减少≥90%的浓度为500–8,000 μg/mL（最常发生于2,000 μg/mL，33.3%菌株）。显著清除已形成生物膜所需的THY浓度比抑制生物膜形成高4–32倍，表明生物膜结构使白色念珠菌对THY的敏感性降低数倍。Spearman秩相关检验显示，MIC与≥50%生物膜抑制浓度（R = 0.82, p = 0.01）、MFC与≥50%生物膜抑制浓度（R = 0.85, p = 0.01）以及MFC与≥90%生物膜抑制浓度（R = 0.79, p = 0.02）之间均存在强正相关。

（三）THY的作用机制

山梨醇试验结果显示，在含0.8 M山梨醇的培养基中，THY对两株参考菌株的MIC值在孵育7天后均未发生变化，表明THY的抗真菌活性可能与抑制细胞壁合成机制无关。麦角固醇试验结果显示，在补充外源麦角固醇（400 μg/mL）的培养基中，THY的MIC值较无麦角固醇培养基升高8–16倍；制霉菌素（nystatin，NYS）作为阳性对照，其MIC值升高16倍。这些结果表明THY可能作用于真菌细胞膜，干扰麦角固醇的功能，增加离子通透性，最终导致真菌细胞死亡。

（四）THY对菌丝化过程的影响

菌丝化试验显示，THY以浓度依赖性方式抑制白色念珠菌的菌丝形成。在1/4 MIC（31.25 μg/mL）浓度下，THY仅减弱菌丝化过程但未完全抑制；在1/2 MIC（62.5 μg/mL）浓度下，菌丝化过程几乎被完全抑制；在MIC（125 μg/mL）浓度下，芽管萌发被完全抑制。对照组中，白色念珠菌细胞表现出强烈的菌丝化能力，产生大量芽生孢子和厚壁孢子。

（五）THY对黏附和生物膜形成相关基因表达的影响

从30株临床菌株中选取10株强生物膜产生菌进行基因表达研究。这些菌株的MIC和MFC范围分别为125–500 μg/mL和250–1,000 μg/mL。RT-qPCR分析显示，在生物膜形成条件下，BCR1基因的未校正p值最小（p = 0.010），但经Benjamini?Hochberg校正后不再具有统计学显著性（q = 0.080）。ALS3和NRG1（均为p = 0.065, q = 0.141）以及HWP1（p = 0.084, q = 0.141）显示出非显著的方向性趋势。浮游条件下，所有基因均未显示统计学显著变化（所有未校正p ≥ 0.193；所有q = 0.770）。基于中位ΔCt值的描述性比较显示，ALS3显示出最大的中位来源降低（ΔΔCt = +2.10；RQ = 0.23，约降低4.3倍），而NRG1显示出最大的中位来源升高（ΔΔCt = ?2.25；RQ = 4.76）。BCR1显示出较小的中位来源升高（ΔΔCt = ?1.51；RQ = 2.84）。层次聚类分析显示，THY诱导的转录反应具有显著的菌株间异质性，不同临床分离株在基因调控的方向和幅度上存在显著差异。

五、讨论与结论

讨论部分：关于THY对浮游和生物膜相关白色念珠菌细胞的作用，文献中MIC值存在较大差异（从1.56 μg/mL到80,000 μg/mL），可能与化合物纯度、测试方法、培养基类型、接种量、孵育条件及菌株类型等因素有关。本研究获得的MIC值（62.5–500 μg/mL）与多数文献报道一致。生物膜相关细胞需要显著更高的THY浓度（4–32倍）才能被抑制或清除，这与生物膜对抗真菌药物固有耐药性增强的特征一致。机制研究方面，山梨醇试验结果与Castro等研究者一致，均表明THY的抗真菌活性与细胞壁合成途径无关；麦角固醇试验结果与文献报道相符，支持THY可能通过干扰麦角固醇而作用于真菌细胞膜。THY的疏水化学结构有利于其沉积于真菌细胞膜的亲脂性成分上。菌丝化抑制方面，THY在1/2 MIC浓度下几乎完全抑制菌丝形成，这与Jafri和Ahmad、Abu Shaban和Darmani等研究者的观察一致。基因表达方面，探索性RT-qPCR数据与Priya等报道的THY暴露可增加负调控因子NRG1和TUP1表达、降低菌丝发育相关基因表达的结论在方向上基本一致，但本研究数据未达到校正后的显著性阈值。

结论：THY对白色念珠菌展现出多方向的抗念珠菌作用机制，包括杀菌活性、抗生物膜活性、作用于真菌细胞膜（干扰麦角固醇）以及抑制菌丝化过程（降低黏附能力）。这些发现提示THY在口腔念珠菌感染的预防和治疗中具有潜在的应用前景。