利用工程化植物乳杆菌从乳制品残渣高效生产D-乳酸

《Fermentation》：Enhanced D-Lactic Acid Production from Dairy Residues Using Engineered Lactiplantibacillus plantarum

　　

中文摘要翻译 乳制品工业产生大量富含乳糖的残渣，这些残渣可被发酵成一系列有价值的产品。在本研究中，研究人员试图利用一株缺失L-乳酸脱氢酶基因（ldhL1）的工程化植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）ATCC BAA-793菌株（以下简称LdhL1），将初始乳糖浓度约为150 g/L的浓缩奶酪乳清（concentrated cheese whey，CCW）发酵为D-乳酸（D-lactic acid，D-LA）。在使用乳糖补充的实验室MRS培养基进行的实验中，由LdhL1产生的乳酸中超过99%为D-型立体异构体，而野生型（wild-type，WT）菌株则等摩尔产生D-型和L-型乳酸（L-lactic acid，L-LA）。当使用CCW作为乳糖和必需营养素的主要来源时，大部分乳糖在7天内被发酵。然而，在CCW与MRS的混合培养基中，使用高密度LdhL1培养物的发酵在不到1天内完成，产生了约75 g D-LA/L的D-乳酸滴度，其中94%的乳酸为D-LA异构体，生产速率约为3.7 g D-LA/(L·h)。该发酵工艺实现了从乳制品残渣生产D-乳酸的最高滴度和速率之一，是将富含乳糖的乳制品残渣资源化利用的重要一步。

论文解读文章

1. 研究背景与目的

乳制品加工过程中，约85%的牛奶体积最终成为低价值的液态残渣。这些残渣富含乳糖，经济价值低，其处理或处置常给农场主和行业带来财务负担。因此，将这些未充分利用的资源转化为有价值的产品具有重大意义。

本研究旨在选择性地将乳制品残渣发酵为D-乳酸（D-LA）。D-LA是生产聚乳酸（polylactic acid，PLA）的关键前体单体。由L-乳酸（L-LA）衍生的聚L-乳酸（PLLA）是目前主要的工业PLA聚合物，但由D-LA单体制成的聚D-乳酸（PDLA）因其与PLLA混合后能改善聚合物的热稳定性和机械稳定性而备受关注。目前，乳酸单体通常通过发酵食品级原料生产，糖及其他营养素（如氨基酸和维生素）的来源是生产成本的主要驱动因素。已有研究评估了使用乳清渗透液和酸乳清等富含乳糖的乳制品残渣生产D-LA浓缩液，但这些残渣中的乳糖浓度受限于牛奶中该二糖的浓度（约40 g/L），导致D-LA滴度远低于使用葡萄糖溶液时的水平。

为解决此问题，本研究使用了浓缩奶酪乳清（CCW），这是一种从乳清中提取所有食品价值副产品后的残余产品，含有约150 g/L的乳糖。研究人员旨在评估与使用较低乳糖浓度的乳制品副产品相比，是否能以更高速率生产出更高滴度的D-LA。

2. 主要技术方法

研究人员采用了以下关键技术方法：

• •
  菌株工程改造：通过同源重组技术，对植物乳杆菌（L. plantarum）ATCC BAA-793野生型菌株进行基因编辑，构建了缺失L-乳酸脱氢酶基因（ldhL1）的突变株LdhL1。
• •
  发酵实验：在1.4 L平行生物反应器系统中进行分批发酵，控制pH为6.0、温度为37°C、搅拌速度为200 rpm。所有实验均设置三次生物学重复。
• •
  产物分析方法：使用高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）测定碳水化合物和有机酸；使用液相色谱-质谱联用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）系统定量区分D-LA和L-LA立体异构体。
• •
  微生物群落分析：对发酵结束后的微生物群落进行16S rRNA基因序列分析。
• •
  成本分析：使用BioSTEAM软件进行过程模拟、技术经济分析和不确定性分析，比较以葡萄糖和CCW为底物生产D-LA的成本。

3. 研究结果

3.1 L. plantarum ΔldhL1突变体的构建**

研究人员通过同源重组成功构建了缺失ldhL1基因的LdhL1突变株。PCR扩增和全基因组测序均证实了该框内缺失的成功。

3.2 在实验室培养基中野生型和LdhL1菌株的乳酸生产

在乳糖补充的MRS培养基中，LdhL1和野生型菌株的生长、乳糖消耗和总乳酸产量相似。然而，野生型菌株几乎等量积累D-和L-LA，而LdhL1菌株优先产生D-LA。随着发酵进行，LdhL1培养物中L-LA浓度降至零，表明D-LA是其唯一产生的乳酸立体异构体。

3.3 LdhL1发酵CCW

当单独使用CCW作为碳源和营养源时，乳糖消耗缓慢，7天后仍未耗尽。尽管初期D-LA占主导，但到发酵末期，两种异构体浓度趋于相等。分析发现，未接种的CCW中也存在发酵微生物（主要是双歧杆菌科和乳杆菌科），它们可能贡献了L-LA的积累。为提高D-LA选择性，研究人员尝试使用更高密度的LdhL1接种物（初始OD₆₀₀=8.5），虽然加快了乳糖利用率，但仍未能维持D-LA的选择性。进一步实验表明，降低CCW在培养基中的比例（从90%降至42%）可缩短发酵时间并提高D-LA选择性。当使用42% CCW时，发酵在一天内完成，总乳酸中D-LA占比达到92.6%。

3.4 MRS添加对LdhL1发酵CCW产D-LA的影响

为验证营养补充的重要性，研究人员在60% CCW替换条件下添加不同量的无糖MRS粉末。结果显示，增加MRS添加量显著缩短了发酵时间。当添加10.6 g MRS时，所有重复实验均在一天内完成，D-LA选择性高达91.2%-96.0%，平均D-LA生产速率为3.7 g D-LA/(L·h)，滴度约为75 g D-LA/L，得率约为1.0 g D-LA/g乳糖。

4. 讨论与结论

讨论部分总结：

研究结果表明，CCW虽富含乳糖，但缺乏支持LdhL1快速发酵的营养素。单独使用CCW时发酵缓慢，且因CCW中其他乳酸菌的竞争导致D-LA选择性丧失。即使采用高密度接种也无法完全克服此问题。只有当同时使用高密度接种和营养补充（MRS）时，才能实现快速发酵和高D-LA选择性。与文献报道的其他研究相比，本研究的D-LA滴度和生产率处于领先水平，仅次于Liu等人的研究，但发酵速度更快。与使用葡萄糖的研究相比，本研究的速率和得率相当，但因乳糖溶解度较低，滴度较低。简化的成本分析显示，若营养补充剂成本可控，以CCW为底物生产D-LA的最低售价（minimum selling price，MSP）可与葡萄糖路线竞争。然而，营养补充剂的成本是影响整体经济性的关键因素。

结论部分翻译：

本研究展示了将CCW转化为D-LA浓缩液的过程，其在滴度、速率和得率方面均处于利用乳制品残渣生产D-LA研究的高端水平。研究中使用的是直接从奶酪生产中获得的CCW，该废物流不仅营养不足，还可能含有来自乳品加工的微生物，这些微生物会干扰工程化植物乳杆菌菌株选择性生产D-LA。研究结果与以下假设一致：要实现LdhL1的高D-LA生产率，需要创造能最小化CCW中其他细菌生长的条件。本研究通过提高植物乳杆菌培养物密度并提供营养补充以支持LdhL1快速生长，从而维持了对D-LA生产的选挥性。在大规模生产中，可能还需要在发酵前对CCW进行巴氏杀菌或灭菌处理。观察到的D-LA生产速率和得率与使用食品级葡萄糖的报告相当，筛选成本分析表明，如果能降低营养补充剂的成本，从乳糖生产D-LA的成本可能与从葡萄糖生产具有竞争力。鉴于从奶酪乳清中回收食品级副产品的行业实践，CCW及类似乳制品残渣天生缺乏一种或多种营养素。因此，有必要研究使用更廉价的营养补充剂来改善该工艺的经济性。可能的廉价营养源包括其他乳制品加工过程中产生的富含营养的副产品，或者减少CCW生产前的处理步骤以保留更多营养素。然而，筛选成本分析也表明，通过增加营养添加量来提高生产率并不利于总体成本的降低。总之，尽管营养补充是发酵成本的主要组成部分，但研究结果表明，使用未经处理的富含乳糖的残渣（如CCW）生产D-LA是可行的，这为乳制品行业创造了从丰富的非食品残渣中生产高价值产品的途径。如果营养补充剂用量保持低位，基于乳糖的D-LA生产成本与基于葡萄糖的生产成本相近。寻找替代的廉价营养源和提高CCW发酵过程中的D-LA选择性仍是重要的研究方向。