基于光遗传学定量解析收缩历史对离体膀胱力学行为的影响

《Acta Biomaterialia》：Quantifying the influence of contraction history on ex vivo bladder mechanics using optogenetics

　　

摘要专业翻译 排尿周期涉及膀胱随尿液逐渐蓄积的被动扩张，以及排尿过程中逼尿肌的主动收缩。与其他组织相比，膀胱的高顺应性归因于逼尿肌内平滑肌细胞（Smooth Muscle Cells, SMCs）与细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）之间的相互作用。当前离体（ex vivo）表征膀胱力学的方法涉及被动加载与卸载，并未包含逼尿肌的主动收缩。在这些测试过程中，膀胱不会恢复到原始构型，从而导致应变软化（strain softening）。研究人员假设在机械测试的卸载阶段诱导受控的离体逼尿肌收缩，通过最小化仅被动机械测试中发生的应变软化，可提高数据的生理相关性。研究人员将光遗传学介导的平滑肌收缩与定制机械测试平台相结合，与标准机械测试方法相比，分析了膀胱组织的力学变化。利用在平滑肌细胞中表达通道视紫红质-2（channelrhodopsin-2, ChR2）的小鼠模型，研究人员对膀胱环进行了循环机械测试，分别在有和无光遗传学刺激的条件下进行。仅被动测试导致组织顺应性增加和应变软化。相反，在卸载期间诱导向心收缩（concentric contraction）则保持了组织的原始构型。该方法将使未来的研究能够将ECM和细胞组织的变化与膀胱力学联系起来，从而改进驱动体内（in vivo）行为计算分析的本构描述。

论文解读

一、研究背景与问题

排尿周期是膀胱储尿与排尿的动态生理过程，涉及膀胱随尿液蓄积的被动扩张和排尿时逼尿肌的主动收缩。健康膀胱能够在低压下储存大量尿液，是人体中可扩张性最强的组织之一。膀胱壁由多层结构组成，包括外层的浆膜层（adventitia）、中层的逼尿肌（detrusor）、固有层（lamina propria）和最内层的尿路上皮（urothelium）。其中逼尿肌由细胞外基质（ECM）和平滑肌细胞（SMCs）构成，是排尿收缩的主要执行结构。

膀胱的力学顺应性由多种机制共同调控。在被动变形过程中，平滑肌细胞内的肌动-肌球蛋白横桥（actomyosin cross-bridges）发生“滑移”，导致收缩单位延长，这一过程被认为是应变软化的细胞机制之一。膀胱壁在持续压力下还会经历类似蠕变的扩张，这与横桥动力学以及ECM和SMCs的黏弹性特性相关。ECM的展开机制，包括固有层高度折叠的皱襞（rugae）的展平以及波浪状胶原纤维的拉直，使组织能够在低压下扩张，随后随着ECM纤维开始拉直和参与承载而出现硬化效应。

目前离体膀胱力学测试面临的核心问题在于：传统方法仅进行被动加载和卸载，无法反映逼尿肌主动收缩对组织力学行为的贡献。在仅被动测试过程中，膀胱组织无法完全恢复到原始构型，后续加载表现出增加的组织顺应性，即应变软化现象。在体内，应变软化通过排尿时的逼尿肌收缩得以避免。然而，离体机械测试中应变软化的存在限制了准确测量膀胱组织材料性能的能力，阻碍了具有生理相关性的本构模型的发展，进而影响对体内膀胱行为的计算分析与预测。因此，开展这项研究的核心动机在于：在离体机械测试中引入可控的收缩与松弛过程，以提高数据的生理相关性。

二、主要技术方法

研究人员采用光遗传学技术实现离体膀胱组织的可控收缩。研究使用了SM22-Cre^tg;ChR2(H134R)-EYFP小鼠模型（n=7，5只雄性，2只雌性，8-11月龄），该模型在平滑肌细胞中特异性表达通道视紫红质-2（ChR2）。机械测试在定制的浮台（buoy-based）测试平台上进行，配备455 nm二极管激光器和光学纤维，以100 Hz脉冲频率、10%占空比照射样本，产生约10 mW/mm2的辐照度。膀胱环（bladder rings）取自膀胱中体区域的环形切片，安装于0.79 mm不锈钢销钉上进行循环力学测试。测试包括两种方案：仅被动测试（passive-only）和向心收缩测试（concentric-contraction），后者在卸载至零力时启动光遗传学刺激诱导收缩。组织变形通过显微镜摄像系统记录，采用Kanade-Lucas-Tomasi和聚合通道特征目标检测器追踪销钉位置，计算拉伸比（stretch, λ）。应力按初始横截面积归一化计算（第一Piola-Kirchhoff应力）。此外，研究还进行了应力松弛测试（n=1），结合双光子显微镜（GEMINI Olympus FVMPE-RS）对组织微结构进行成像，包括二次谐波产生（SHG）成像观察胶原纤维和EYFP荧光成像观察平滑肌细胞。本构建模采用指数型连续介质力学模型描述被动加载的应力-拉伸响应。

三、研究结果

3.1 循环力学测试

代表性数据显示，仅被动测试中，膀胱环在卸载后未能恢复到原始构型，表现出应变软化现象，组织顺应性随循环次数增加而增大。相比之下，向心收缩测试中，在卸载阶段施加光遗传学诱导的逼尿肌收缩后，组织能够恢复到接近原始的构型，有效逆转了前一次加载循环产生的应变软化。两种测试类型的第1个循环均与第2-5个循环存在差异，但向心收缩测试中后续循环的应力-拉伸曲线形态与仅被动测试显著不同。所有样本平均后的第5次循环加载曲线显示，两种测试类型之间曲线形状存在明显差异，表明收缩历史对后续被动加载行为产生了显著影响。

3.2 应力松弛测试与微结构成像

应力松弛测试中，膀胱组织在加载至5 kPa应力后卸载至零力，随后通过光遗传学刺激收缩回原始长度。双光子显微镜成像显示，在这一状态下可以同时观察胶原纤维（SHG信号）和平滑肌细胞（EYFP信号）的微结构形态。组织在收缩状态下与拉伸状态下的微结构构型存在差异，为理解主动收缩对被动结构成分微观构型的影响提供了直接证据。

3.3 本构模型分析

采用指数型应变能函数W(C) = (c₁/2c₂)[e^c₂(trC?3) ? 1]对被动加载的应力-拉伸响应进行拟合。该现象学模型用于捕捉两种测试类型之间曲线形状的变化。模型拟合结果表明，仅被动测试与向心收缩测试所得到的材料参数存在差异，反映了收缩历史对组织被动力学性能的调制作用。

四、讨论与结论

本研究的核心发现是：在离体机械测试的卸载阶段引入光遗传学介导的逼尿肌向心收缩，能够有效逆转前一次加载循环产生的应变软化，使组织恢复到接近原始的构型。这一结果证实了研究人员的假设，即在卸载阶段诱导受控的离体逼尿肌收缩可以最小化仅被动机械测试中出现的应变软化，从而提高数据的生理相关性。

研究结果表明，收缩历史对膀胱组织的被动力学行为具有显著影响。在体内，排尿时的逼尿肌收缩不仅完成尿液排出，还可能在微观结构层面重置被动结构成分的构型，从而影响后续充盈阶段的被动力学特性。这一机制在传统的仅被动离体测试中完全缺失，导致测得的数据与体内真实力学行为存在偏差。

该研究的重要意义在于：第一，提供了一种将主动收缩纳入离体机械测试的新方法，提高了离体膀胱力学数据的生理相关性；第二，强调了在分析力学数据时选择正确参考构型来定义拉伸的重要性；第三，该方法可推广至其他含活性平滑肌组织的力学研究，如呼吸道和胃肠道组织；第四，为研究膀胱功能障碍（如衰老、膀胱出口梗阻、神经源性膀胱）的疾病进展和治疗评估提供了新的实验工具，使研究人员能够在疾病模型中测量应变软化及组织在向心收缩后的重置能力，并在药理干预前后进行比较。

综上所述，本研究通过光遗传学技术成功地将主动收缩整合到离体膀胱力学测试中，揭示了收缩历史对膀胱组织力学行为的定量影响，为改进膀胱力学本构模型和推动计算分析提供了重要的实验基础。