《Advanced Agrochem》：The sterol regulatory transcription factor FpSR coordinates fungicide tolerance, metabolism, and virulence in
Fusarium pseudograminearum
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田间分离的戊唑醇敏感性降低菌株表现出增强的CYP51基因诱导表达。FpSR直接激活FpCYP51基因并调控伪禾谷镰孢菌（Fusarium pseudograminearum）对DMI类杀菌剂的敏感性。FpSR协调麦角甾醇稳态与广泛的初级代谢重编程。FpSR是胁
田间分离的戊唑醇敏感性降低菌株表现出增强的CYP51基因诱导表达。FpSR直接激活FpCYP51基因并调控伪禾谷镰孢菌（Fusarium pseudograminearum）对DMI类杀菌剂的敏感性。FpSR协调麦角甾醇稳态与广泛的初级代谢重编程。FpSR是胁迫适应与致病性所必需的。伪禾谷镰孢菌是小麦冠腐病（Fusarium crown rot, FCR）的主要病原菌之一，该病害是影响全球小麦及其他谷类作物的毁灭性土传病害。近年来，在集约化谷物生产和保护性农业措施下，FCR发病率上升，造成严重的产量和品质损失。除直接危害作物生产外，伪禾谷镰孢菌还可产生多种真菌毒素，包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol, DON），对食品安全和动物健康构成严重威胁。鉴于抗FCR小麦品种的有限性，杀菌剂仍是小麦FCR防治的主要策略。麦角甾醇是真菌细胞膜的主要甾醇成分，在维持膜完整性、通透性、流动性和细胞稳态中发挥不可或缺的作用。麦角甾醇生物合成途径因此被广泛用作抗真菌化合物的靶标。甾醇14α-脱甲基酶（CYP51，又称Erg11）是催化麦角甾醇生物合成关键步骤的细胞色素P450酶，构成甾醇脱甲基抑制剂（sterol demethylation inhibitor, DMI）类杀菌剂（包括戊唑醇和丙硫菌唑）的主要分子靶标。DMI类杀菌剂因其高效性和内吸活性而被广泛用于小麦真菌病害防治。然而，DMI类杀菌剂的大量施用对真菌群体施加了日益增加的选择压力，导致田间抗性菌株的出现。真菌病原菌DMI敏感性降低与多种机制相关，包括CYP51基因突变、CYP51基因转录上调以及外排增强。其中，CYP51表达的转录调控是DMI适应的重要但尚不清楚的方面，尤其在镰孢菌属中。甾醇生物合成受多种转录调控因子控制，这些因子维持甾醇稳态并影响真菌对甾醇靶向抗真菌化合物的适应。在哺乳动物中，甾醇调节元件结合蛋白（sterol regulatory element-binding proteins, SREBPs）通过甾醇依赖性激活调节胆固醇稳态。在多种真菌中也发现了类似的SREBP介导的调控系统，如烟曲霉（Aspergillus fumigatus）、新生隐球菌（Cryptococcus neoformans）和粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe），其中SREBP同源物（如SrbA和Sre1/2）调节甾醇生物合成和对甾醇缺乏的适应。在酵母亚门（Saccharomycotina）中，Upc2作为麦角甾醇生物合成的主要转录调控因子，通过感知细胞内甾醇水平并在甾醇耗竭条件下激活甾醇生物合成基因。相比之下，丝状真菌，特别是粪壳菌纲（Sordariomycetes）和锤舌菌纲（Leotiomycetes）中的真菌，似乎进化出一类独特的真菌特异性甾醇调控因子，以FgSR同源物为代表，协调包括CYP51家族成员在内的麦角甾醇生物合成基因的转录。然而，SR介导的甾醇调控是否在伪禾谷镰孢菌中代表保守机制，以及它如何影响DMI耐受性和致病性，仍不清楚。在本研究中，田间调查发现戊唑醇敏感性降低的伪禾谷镰孢菌分离株表现出强烈的戊唑醇诱导的靶标FpCYP51基因表达，表明甾醇生物合成基因的转录调控可能有助于DMI耐受性。随后，FpSR被鉴定为甾醇生物合成的关键转录调控因子，直接激活FpCYP51A、FpCYP51B和FpCYP51C响应戊唑醇的表达。此外，FpSR协调广泛的初级代谢重编程，并影响DON生物合成、胁迫适应和真菌致病性。综上所述，这些发现确立了FpSR作为连接伪禾谷镰孢菌杀菌剂耐受性、代谢和致病性的中枢调控枢纽。
论文解读
一、研究背景与科学问题
伪禾谷镰孢菌（Fusarium pseudograminearum）是小麦冠腐病（Fusarium crown rot, FCR）的主要病原菌，该病害在全球小麦和谷类作物产区造成严重产量损失。除直接危害外，该病原菌还能产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol, DON）等真菌毒素，威胁食品安全。由于缺乏有效抗性品种，化学防治尤其是甾醇脱甲基抑制剂（DMI）类杀菌剂（如戊唑醇、丙硫菌唑）仍是主要防控手段。DMI类杀菌剂通过靶向甾醇14α-脱甲基酶（CYP51）抑制麦角甾醇生物合成。然而，长期大量施用导致田间抗性菌株不断出现。CYP51基因过表达是DMI抗性的重要机制之一，但其上游转录调控机制在镰孢菌中尚不清楚。在丝状真菌中，以FgSR为代表的真菌特异性甾醇调控因子可协调麦角甾醇生物合成基因的转录，但该机制在伪禾谷镰孢菌中是否保守、如何参与DMI耐受性和致病性调控，此前未见报道。因此，阐明伪禾谷镰孢菌中甾醇调控因子的功能和调控网络，对理解DMI抗性机制和开发可持续防控策略具有重要意义。
二、研究内容与主要结论
研究人员从田间采集389株伪禾谷镰孢菌分离株，检测其对5种常用杀菌剂的敏感性，发现戊唑醇抗性频率相对较高。选取4株代表性抗性菌株，发现其FpCYP51A和FpCYP51B在戊唑醇处理后表达水平显著高于野生型，表明CYP51基因协同上调与DMI敏感性降低相关。通过系统发育分析鉴定出三个FpCYP51旁系同源基因，功能验证表明FpCYP51B缺失导致营养生长显著降低并对丙硫菌唑敏感性增加，而FpCYP51A和FpCYP51C缺失无明显表型效应。以禾谷镰孢菌FgSR为查询序列进行BLASTp检索，鉴定出伪禾谷镰孢菌中的同源蛋白FpSR（FPSE_02607），该蛋白含锌指结构域和真菌特异性转录因子结构域，定位于细胞核。FpSR基因缺失突变体在PDA培养基上菌丝生长减少60.5%，对戊唑醇和丙硫菌唑表现出超敏感性，但对非DMI类杀菌剂（多菌灵和氰烯菌酯）敏感性不变。RT-qPCR证明FpSR缺失显著削弱戊唑醇对三个FpCYP51基因的转录诱导；ChIP-qPCR和EMSA证实FpSR直接结合三个FpCYP51基因启动子中的保守基序（TGCGAATACGAATGCG）。在田间抗性菌株中敲除FpSR同样显著增加戊唑醇敏感性并降低FpCYP51基因表达。进一步研究发现，ΔFpSR突变体对靶向麦角甾醇生物合成途径不同步骤的6种甾醇生物合成抑制剂（SBIs）均表现出超敏感性，且多个麦角甾醇合成基因表达下调，菌丝麦角甾醇含量降低。此外，FpSR缺失显著降低DON产量和TRI基因表达，减弱小麦胚芽鞘和穗部的致病性，并增加对渗透胁迫和氧化胁迫的敏感性。转录组分析鉴定出4204个差异表达基因（DEGs），其中下调基因富集于糖酵解/糖异生、淀粉和蔗糖代谢、氨基酸代谢等初级代谢通路。代谢组分析鉴定出756个差异代谢物，主要涉及氨基酸代谢和初级代谢。多组学整合分析显示FpSR直接结合多个初级代谢基因的启动子（基序TCCCTCGCAC），经ChIP-qPCR和EMSA验证了10个直接靶基因。
三、主要关键技术方法
研究人员使用的主要技术方法包括：田间菌株采集与杀菌剂敏感性表型测定（基于菌落直径生长抑制法）；重叠PCR结合PEG介导的原生质体转化进行基因敲除与GFP标记互补菌株构建；RT-qPCR进行基因表达分析；RNA测序（RNA-Seq）与生物信息学分析（以伪禾谷镰孢菌CS3096为参考基因组，DESeq2筛选DEGs）；基于UHPLC-MS/MS的非靶向代谢组学分析；染色质免疫沉淀-qPCR（ChIP-qPCR）和凝胶迁移率变动分析（EMSA）验证转录因子与靶基因启动子的直接结合。
四、研究结果
3.1 FpCYP51基因表达升高与田间菌株DMI敏感性降低相关：对389株田间分离株的敏感性筛查显示戊唑醇抗性频率较高。4株代表性抗性菌株在戊唑醇处理后FpCYP51A和FpCYP51B表达显著高于野生型，表明CYP51基因协同转录上调可能促进田间DMI抗性。
3.2 FpCYP51基因对戊唑醇具有转录响应且在DMI敏感性中功能分化：三个FpCYP51基因均受戊唑醇诱导，其中FpCYP51A响应最强。基因敲除实验表明FpCYP51B缺失导致营养生长显著下降并对丙硫菌唑敏感性增加，而FpCYP51A和FpCYP51C缺失无明显表型效应。
3.3 FpSR调控FpCYP51基因对DMI的响应：FpSR定位于细胞核，其缺失导致菌丝生长减少60.5%并对DMI类杀菌剂超敏感。FpSR直接结合三个FpCYP51基因启动子中的保守基序并激活其转录。在田间抗性菌株中敲除FpSR同样增加戊唑醇敏感性并降低FpCYP51基因表达。
3.4 FpSR是伪禾谷镰孢菌甾醇生物合成的主调控因子：ΔFpSR突变体对6种靶向麦角甾醇途径不同步骤的SBIs均表现超敏感性，多个甾醇合成基因表达下调，菌丝麦角甾醇含量降低，表明FpSR在多个转录节点协调甾醇生物合成途径。
3.5 FpSR协调DON生物合成、胁迫适应和致病性：FpSR缺失显著降低DON产量和TRI基因表达，减弱小麦胚芽鞘和穗部致病性及真菌生物量积累，并增加对NaCl、KCl、VK3和3-AT的敏感性。
3.6 FpSR缺失引发全局转录重编程：转录组分析鉴定出4204个DEGs（2151个上调，2053个下调），下调基因富集于糖酵解/糖异生、淀粉和蔗糖代谢、氨基酸代谢等初级代谢通路。
3.7 FpSR缺失主要破坏初级代谢：代谢组分析鉴定出756个差异代谢物（226个升高，530个降低），主要涉及氨基酸代谢和生物合成通路。
3.8 FpSR直接协调核心初级代谢通路：多组学整合分析显示转录与代谢变化高度一致，富集于糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢、磷酸戊糖途径等通路。ChIP-qPCR和EMSA证实FpSR直接结合10个代表性初级代谢基因的启动子（基序TCCCTCGCAC）。
五、讨论与结论
讨论部分指出，FpSR介导的杀菌剂响应主要与DMI类杀菌剂相关，而非一般的杀菌剂敏感性增加。FpSR组成性占据FpCYP51基因启动子，其转录激活活性受DMI诱导的甾醇扰动调节，但具体的甾醇感知和信号转导机制尚待阐明。多组学整合分析表明FpSR通过直接转录调控和下游级联效应对初级代谢产生广泛调控，10个经实验验证的基因代表直接靶标，其余DEGs可能反映间接效应。FpSR缺失导致的DON产量降低、致病性减弱和胁迫敏感性增加，是广泛的代谢扰动而非单一代谢通路缺陷的结果。从应用角度看，靶向FpSR等上游调控因子可能通过破坏调控网络而非单个代谢酶，为克服DMI抗性提供替代策略。
研究结论：本研究证明FpSR是一个定位于细胞核的转录因子，直接调控伪禾谷镰孢菌中的FpCYP51基因和多个初级代谢基因。通过协调麦角甾醇生物合成、代谢重编程、胁迫适应、DON产生和致病性，FpSR广泛调控初级代谢与次级代谢及杀菌剂适应的整合。这些发现不仅拓展了对真菌甾醇调控网络的认识，还为理解DMI杀菌剂抗性的分子机制提供了新见解，为开发创新性抗真菌策略提供了潜在靶标。
