Δccm1（ρ0）酿酒酵母在无乙醇毒性条件下单位生物量乙醇发酵增强的NAD+/NADH与TDH3/ADH1调控机制

《Fermentation》：Anaerobic Digestion of the Soluble Organic Fraction of Municipal Solid Waste Under Inhibition Conditions: Biomass State Observer and Control

　　

研究人员比较了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）ρ⁰突变体与等基因野生型的初始乙醇生产能力，以排除酒精毒性对发酵结果的影响。本研究使用BY 4741菌株与Δccm1突变体杂交产生的减数分裂分离子（meiotic segregants）以考虑生物学变异。研究人员在最初10 min内使用CO₂传感器测量葡萄糖发酵速率，并通过600 nm分光光度法测定生物量。比色法（colorimetric assays）测定酒精浓度和NAD⁺/NADH比值。RNA测序（RNA sequencing）评估参与糖酵解、发酵、NAD⁺依赖性调节和电生成线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential）产生的基因表达。逆转录定量PCR（reverse transcription quantitative PCR, RT-qPCR）测量细胞质核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA）水平。ρ⁰突变体每生物量单位产生的CO₂比野生型多63%，乙醇产量证实了这一点。然而，其倍增时间显著更长，这是ρ⁰突变体的特征。它们还具有较低的NAD⁺/NADH比值、较高的细胞质核糖体RNA，以及若干糖酵解和酒精发酵基因的上调，包括TDH3增加超过4倍，这些均有利于单位生物量获得更好的乙醇产量。这些发现突出了在不受酒精毒性影响的条件下影响酒精生产的遗传和生化因素。

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）酒精发酵受线粒体功能、乙醇毒性、细胞质NAD⁺/NADH比值及转录调控影响。既往研究通常将呼吸缺陷型ρ⁰或ρ^?菌株与野生型比较并培养超过1天，乙醇积累后野生型因能消耗乙醇而表现出更高抗性、发酵速率和干生物量，因此线粒体功能看似有利。然而，在发酵初始阶段，培养基乙醇浓度低、尚不需解毒时，ρ⁰与野生型的发酵速率可能不同，且线粒体酶活性受抑制时NAD⁺/NADH比值尚未在两者间比较。NAD⁺是糖酵解中3-磷酸甘油醛脱氢酶（由TDH2和TDH3编码）产生NADH时被消耗的辅因子，也是细胞质乙醇脱氢酶（由ADH1编码）将乙醛还原为乙醇所必需；NAD⁺可用性降低会抑制Sir2p和Hst1p沉默因子活性，从而影响ENO2、CDC19、PDC1等糖酵解和发酵基因。ρ⁰突变体缺乏线粒体DNA（mtDNA），不能进行有氧呼吸，依赖糖酵解和酒精发酵供能；mtDNA缺失还通过破坏RIM15磷酸化促进乙醇生产。Δccm1突变体因线粒体翻译缺失而表现为ρ⁰细胞，无线粒体电子传递链和氧化磷酸化。研究人员据此假设：Δccm1（ρ⁰）细胞重新暴露于新鲜葡萄糖培养基时，若NAD⁺/NADH比值显著较低，则其由葡萄糖生产乙醇的速率高于野生型；并通过BY4741与Δccm1突变体杂交产生的减数分裂分离子增加遗传变异，检验该效应是否普遍。其意义在于揭示不受酒精毒性影响条件下影响乙醇产量的遗传和生化因素。

关键技术方法：以BY4741（MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0）与Δccm1突变体（MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 ccm1Δ0::kanMX；Revvity Discovery）杂交，经减数分裂、孢子分离和YEPG/YEPD-G418筛选获得野生型和突变型分离子，并用DAPI及mtDNA/nDNA定量PCR确认ρ⁰。发酵速率用CO₂传感器在30 °C、400 rpm下测最初10 min CO₂产量，以600 nm吸光度（AU）归一化；乙醇用试剂盒测定；NAD⁺/NADH用EnzyChrom?试剂盒测定；RNA-Seq（AmpSeq）和RT-qPCR分析转录本及18S/25S rRNA。统计采用t检验、Mann–Whitney U检验和回归分析等。

3.1 减数分裂分离子在YEPD上形成不同大小菌落：通过四分体解剖和YEPG/YEPD-G418鉴定，野生型形成最大菌落、能在YEPG生长而不在YEPD-G418生长；Δccm1分离子菌落显著较小、不能在YEPG生长、能在YEPD-G418生长，反映其倍增时间较长。研究人员还检测ADP/ATP转位酶和F₁亚基表达，发现突变体表达PET9等，部分F₁亚基显著降低，ATP11显著升高，提示其通过反向电生成机制维持最小线粒体膜电位（MMP）并造成能量负担。

3.2 CO₂传感器系统验证：通过测定四种突变体生物量在10 min内的CO₂产量，发现生物量（AU）与CO₂产量（μmol）在至少200 AU范围内线性相关（R=0.9928，p=0.0072），实际实验未达该上限，故后续结果均在线性范围内；CO₂在丙酮酸脱羧酶步骤生成，可作为实时发酵速率指标。

3.3 突变体酵母克隆以显著高于野生型的速率发酵葡萄糖：将15 h野生型和突变体克隆转入新鲜YEPD后测10 min CO₂产量，突变体中位倍增时间比野生型长27%（p<0.0001，n=16），但每AU CO₂产量高63%（p=0.0031，n=16），且两组存活率相同；在发酵速率最高的4个野生型和4个突变体中，突变体乙醇产量为2.5倍（p=0.0286，n=8）；CO₂与乙醇产量强相关（r=0.8266，p=0.0114）。突变体生长缺陷严重，工业应用受限，除非将部分ATP导向细胞增殖。

3.4 突变体克隆显著过表达15个糖酵解和产乙醇酶中的11个：选取3个野生型和3个突变体进行转录组分析，确认3个Δccm1克隆无CCM1转录；11/15个基因包括葡萄糖转运体HXT1显著上调2–4倍（p<0.05），TDH3上调超过4倍；突变体中PGM1表达为野生型2倍以上（p<0.05），但PGM1与PGM2表达差异不显著；除两个磷酸果糖激酶亚基外，多数糖酵解和酒精发酵基因表达升高。

3.5 突变体克隆的基因转录调控有利于CO₂和乙醇生产：突变体NAD⁺/NADH比值降低近2倍（突变体/野生型0.57；p=0.008；n=6）；SIR2和HST1转录水平约为野生型一半（0.51和0.48；p<0.05），其靶基因ENO2、CDC19、PDC1显著上调超过3倍；细胞质25S和18S rRNA在突变体中分别增加40–43%（p<0.05）；RIM15表达降低（0.65；p=0.0309）；MSN2和MSN4表达显著降低（100±8 vs 165±9 TPM；109±21 vs 181±24 TPM；p=0.0028和0.0429）；RDN18-1、RDN18-2、RDN37-1、RDN37-2表达显著增加。TDH3/ADH1比值在突变体为3.04、野生型1.78，突变体产生NADH多于消耗（p=0.0193），导致NAD⁺较低，降低Sir2p/Hst1p沉默活性，上调糖酵解和发酵基因。

3.6 TDH3转录因子和TDH3旁系同源基因表达：高TDH3表达依赖GCR1和RAP1编码的转录因子；这些因子也调控PGK1、ENO1、PYK2和ADH1等。Vande Zande等报道TDH2共享同一调控机制并在TDH3表达降低时剂量依赖性补偿。本研究中突变体三种TDH亚型均上调，但TDH1因生物学变异未达统计学显著；在本实验条件下TDH1和TDH2仅占总TDH表达的三分之一。

讨论部分总结：ρ⁰突变体在初始阶段单位生物量发酵更快，可能因其虽无线粒体DNA仍表达形成最小MSM的基因，维持MMP消耗糖酵解ATP而减慢生长；TDH3/ADH1表达比更高使突变体消耗更多NAD⁺，NAD⁺较低抑制Sir2p/Hst1p，上调乙醇和细胞质rRNA生产相关基因；RIM15、MSN2、MSN4低表达也与高发酵相关。研究人员强调这些发现揭示不受酒精毒性影响条件下影响乙醇生产的遗传和生化因素；但突变体生长缺陷严重，工业应用需使部分ATP转向增殖。

结论翻译：Δccm1突变体最初以高于其等基因野生型的单位生物量速率将葡萄糖发酵为乙醇。然而，即使这些突变体缺乏mtDNA，它们仍表达参与形成最小MSM的基因。生成MSM可能消耗糖酵解产生的一部分ATP，从而减慢突变体生长。由于突变体中TDH3/ADH1表达比高于野生型，突变体消耗的NAD⁺多于其产生的NAD⁺，导致NAD⁺水平较低。相对较低的NAD⁺水平抑制沉默因子Sir2p和Hst1p，从而上调若干参与乙醇和细胞质rRNA生产的基因。总之，这些见解突出了在不受酒精毒性影响的条件下影响乙醇生产的遗传和生化组分。