酵母菌接种对咖啡湿法发酵挥发性化合物形成的影响：本土非酿酒酵母联合菌群的评价

《Fermentation》：Yeast Strain Inoculation in Coffee Wet Fermentation: Impact on Volatile Compound Formation

　　

摘要 发酵剂培养物（starter cultures）通过产生酵母源性挥发性有机化合物（volatile organic compounds，VOCs）提升咖啡感官品质。本研究评估了五种本土酵母菌株——汉逊德巴利酵母（Hanseniaspora guilliermondii）、膜醭毕赤酵母（Pichia membranifaciens）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、球形托鲁拉酵母（Torulaspora globosa）和橙黄红酵母（Rhodotorula aurantiaca）——在黏液（mucilage）、生豆（green beans）及烘焙豆（roasted coffee）中对挥发性有机化合物的贡献。采用2×2+1因子随机完全区组设计（randomized complete block design），评估两种联合菌群（consortia，c1、c2）、两种接种生长阶段（延滞期，lag，t1；指数期，exponential，t2）及一个自然发酵对照。挥发性有机化合物通过顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）分析，感官品质依据精品咖啡协会（Specialty Coffee Association，SCA）协议评估。研究人员对三种基质开展多变量与单变量统计分析，结果表明挥发性化合物谱从黏液和生豆中发酵来源的醇类和酯类，转变为烘焙豆中热生成（thermally generated）的吡嗪类（pyrazines）、呋喃类（furans）和醛类（aldehydes）。处理c2t2在黏液中表现出更高的代谢活性，酸类、醇类和醛类的峰面积增加，而c1t1在生咖啡豆中酸类和酮类的色谱响应更高。在烘焙咖啡豆中，与增强香气和醇厚度相关的化合物峰面积——如1-(2-呋喃基)乙酮（1-(2-furanyl)ethanone）、1-(2-呋喃基)-1-丙酮（1-(2-furanyl)-1-propanone）及吡嗪类——在c2处理中显著更高，而1-羟基-2-丙酮（1-hydroxy-2-propanone）、1-羟基-2-丁酮（1-hydroxy-2-butanone）和1-乙酰氧基-2-丙酮（1-acetyloxy-2-propanone）在t1处理中更高。尽管非参数感官检验未揭示处理间存在统计学显著差异，但c1t1因风味、酸度和平衡度的改善获得了最高的数值总杯测评分（82.63 SCA分）。酵母接种处理的SCA总分比自然发酵对照（79.13分）高出2.6至3.5分，且未产生缺陷性异味（defective off-flavors）。所评估的酵母菌株在有效调控咖啡特定挥发性物质谱和感官属性方面显示出潜力。

咖啡湿法发酵中酵母菌接种对挥发性化合物形成的影响：本土非酿酒酵母联合菌群的系统评价

一、研究背景与问题提出

咖啡发酵在挥发性有机化合物（volatile organic compounds，VOCs）形成中的核心作用已在多项研究中得到证实，通过改变发酵过程可以调控咖啡的化学成分组成。发酵被认为是开发提升咖啡整体品质新方法的有力途径，而发酵剂培养物（starter cultures）的引入则具有潜在优势。酵母作为经典微生物，已在葡萄酒、啤酒和巧克力等产品的香气增强中发挥重要作用。目前学界认识到，酵母在咖啡发酵中的作用远不止产生果胶酶，其在有机挥发性化合物的生成中可能至关重要，这些化合物对咖啡品质十分有益。通过产生有助于风味复杂性的酯类和醇类，酵母在增强咖啡属性、满足市场对差异化咖啡需求方面具有巨大潜力。

已有研究表明，当酵母生长被纳他霉素（natamycin）抑制时，这些理想挥发性化合物显著减少，导致咖啡风味和香气的评分降低。与酵母辅助发酵过程相结合，咖啡豆中特定有机酸、一级和二级醇、酯类和酮类等功能团化合物的浓度增加，从而积极影响品质、减少变异性、获得更稳定的产品，并促进其安全性和保存性。尽管烘焙过程会产生大量决定咖啡品质的化合物，但生豆组成与最终产品之间的关系不容忽视。不同发酵方法的VOCs揭示了有利于咖啡豆后续阶段（如烘焙）成分组成的代谢过程。例如，湿法处理比干法处理能提取更多的多糖和蛋白质，表明其具有更高的游离氨基酸含量，与平衡且有价值的感官属性相关。已有研究证明，某些VOCs（如吡咯类和呋喃类）可能有助于识别发酵方法。

二、研究目的与意义

尽管已有研究探索了酵母接种对咖啡发酵的影响，但多数集中于少数几种酵母（如Saccharomyces cerevisiae、Torulaspora delbrueckii和Pichia fermentans），且主要研究区域在巴西。哥伦比亚咖啡主要采用湿法加工，内生微生物群发挥着重要作用。在这一高度生物多样性的环境中，非酿酒酵母属（Candida、Pichia、Hanseniaspora、Torulaspora、Meyerozyma、Kazachstania和Wickerhamomyces）是酵母群落的主要代表，其存在受产区、品种、加工方法等因素影响。利用本土酵母可能改善高品质咖啡的感官特性，但需要建立合适的菌株筛选方法以选择符合目标风味的菌株。

本研究旨在系统评估五种本土酵母菌株在咖啡湿法发酵中的挥发性化合物贡献，揭示黏液（mucilage，发酵主要底物）、生咖啡豆（中间阶段及化学成分决定因素）和烘焙咖啡豆（最终产品）中挥发性组成的变化，以及咖啡饮品的感官品质。该研究凸显了这些本土酵母菌株在咖啡发酵中的巨大潜力，为未来研究和评估奠定基础。

三、主要关键技术方法

本研究采用多项关键技术方法。菌株鉴定采用培养依赖方法和BIOLOG?系统（Biolog Inc.，Hayward，CA，USA）的代谢谱分析，评估95种底物。实验设计采用2×2+1因子随机完全区组设计（randomized complete block design），以原料品质为区组变量，共4个区组、20次发酵，处理包括两种酵母联合菌群（c1、c2）、两种接种生长阶段（t1延滞期、t2指数期）及自然发酵对照。挥发性有机化合物采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）分析，使用CAR/PDMS纤维（75 μm，Supelco Ref. 57319）和Agilent DBWAX色谱柱（50 m × 320 μm × 1 μm），化合物鉴定基于Wiley 275/NIST 98质谱库，最低谱匹配因子80%，所有报道挥发性物质均为MSI Level 2（暂定注释化合物）。感官品质依据SCA协议由三位Q-Grader资质杯测师评估。统计分析采用多维标度（MDS）、主成分分析（PCA）、置换多元方差分析（PERMANOVA）、方差分析（ANOVA）及Friedman检验等非参数方法。咖啡原料来自哥伦比亚中部咖啡区（4.59 N，75.35 W），海拔1260–1400 m，品种为Coffea arabica L. cv. Castillo。

四、研究结果

4.1 酵母菌株筛选

七株候选酵母在含5%黏液的培养基中产生14种化合物。S. pombe、T. globosa和W. domercquiae产生最高的乙醇、乙醛及其他醇类（1-丙醇、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丁醇）色谱面积；R. aurantiaca和C. apicola乙醇产量最低，发酵能力有限。酯类是最主要的化学家族，乙酸乙酯含量丰富，尤其在H. guilliermondii和P. membranifaciens中；P. membranifaciens是唯一产生乙酸苯乙酯的菌株。酮类中，Schizosaccharomyces、Rhodotorula和Hanseniaspora属产生较高量的乙偶姻（acetoin）。MDS相似性分析鉴定出三个不同的酵母群组：C. apicola和R. aurantiaca组产生低乙醇及相关酯类；W. domercquiae、T. globosa和S. pombe组产生较高乙醇和其他醇类；P. membranifaciens和H. guilliermondii组表现出最高的果香和花香相关酯类水平。最终选择五种酵母构成两个联合菌群：c1（H. guilliermondii、S. pombe、R. aurantiaca，源自同一发酵过程）和c2（P. membranifaciens、T. globosa、S. pombe，源自不同发酵过程）。

4.2 有机挥发性化合物总体特征

三种样品类型共鉴定出81种化合物：黏液34种、生豆28种、烘焙豆51种。黏液和生豆中醇类和酯类（发酵相关）占主导，但在豆子转化过程中相对丰度下降；醛类和酮类数量增加，成为烘焙咖啡中最具代表性的基团。烘焙过程中，呋喃类、吡嗪类、吡啶类和吡咯类形成，美拉德反应（Maillard reaction）发挥重要作用。异丁醛（2-甲基丙醛）由酵母产生，在烘焙咖啡中作为斯特雷克反应（Strecker reaction）的产物，是哥伦比亚阿拉比卡咖啡特征香气的主要化合物。

4.3 咖啡黏液中的挥发性有机化合物

黏液基质中检测到的大多数化合物是发酵过程的产物，且黏液具有最大的累积色谱峰面积。酯类是最丰富的化学家族，乙酸酯类（特别是乙酸乙酯）最为普遍。67.6%的挥发性化合物（主要是醇类、酯类和酸类）在实验区组间存在显著差异，表明区组因子（基于每个区组的咖啡特性）强烈影响这些化合物的色谱响应。34种化合物中有6种受实验因子显著影响：生长阶段显著影响2-甲基-1-丙醇（p = 0.0427）；联合菌群显著影响乙酸乙酯（p = 0.0304）和3-甲基-2-丁烯醇乙酸酯（p = 0.0325）；对照处理的3-甲基丁酸（p = 0.0189）、3-羟基-2-丁酮（p = 0.0174）和丙酸乙酯（p = 0.0272）显著高于其他处理。c2t2处理表现出最高的VOC总色谱面积，c1t2的VOC较少，表明其发酵能力降低。

4.4 生咖啡豆中的挥发性有机化合物

生咖啡豆基质中28种化合物仅有3种受实验区组显著影响，表明生咖啡的挥发性谱独立于咖啡果品质。三种酯类受实验设计显著影响：乙酸甲酯存在显著交互效应（p = 0.0232）；乙酸乙酯在c1处理中显著更高（p = 0.0384）；异戊酸乙酯在对照中显著更高（p = 0.0417）。接种生长阶段（t1和t2）未对任何化合物产生显著影响。种植海拔（1260–1400 m）低于酵母分离来源的发酵海拔（1850 m），导致某些化合物积累略有减少。

4.5 烘焙咖啡豆中的挥发性有机化合物

烘焙咖啡最具代表性的化合物包括乙酸、2,3-丁二酮、1-羟基-2-丙酮、2-呋喃甲醛和2-甲基吡嗪。51种化合物中有19种受发酵处理显著影响。2-甲基吡嗪存在显著的联合菌群与生长阶段交互效应（p = 0.0288）。延滞期接种（t1）显著增加了乙酸、1-羟基-2-丙酮、1-羟基-2-丁酮、1-乙酰氧基-2-丙酮、2-呋喃甲醇、2-呋喃甲醛和2,3-二氢呋喃酮的色谱面积；指数期（t2）则使2,5-二甲基呋喃峰面积更大。大多数吡嗪类、吡啶类和吡咯类在c2处理中色谱面积显著更大。PCA显示烘焙咖啡基质的前两个主成分累计方差为69.10%（PC1：42.17%，PC2：26.93%），表明热过程在挥发性化合物间产生相关模式。与对照相比，c2t1处理产生最显著效应，显著增加所有吡嗪类及关键呋喃类和吡咯类；c1t2显著增加呋喃类和醛类；c2t2显著增加关键吡嗪类和2,5-二甲基呋喃；c1t1与对照最相似，无显著差异。

4.6 感官分析

所有接种联合菌群的样品均无感官缺陷，干净杯、甜度和均匀性获得最高分（10分）。对照处理的一杯样品出现酚类异味缺陷，影响总分（73 SCA分）。Friedman检验显示处理间无统计学显著差异（χ2(4) = 3.69，p = 0.449），Wilcoxon符号秩检验经Holm–Bonferroni校正后亦无显著差异。但酵母接种处理的SCA平均分比对照高出2.6至3.5分，尤其在醇厚度、风味和酸度方面表现更佳。c1t1获得最高数值总杯测评分（82.63 SCA分），具有明亮酸度和干净风味特征，描述为蜂蜜、巧克力和花生香调；c2处理更常被描述为果香和柑橘调，可能解释其较高的香气评分。对照处理表现出蜂蜜、巧克力和杏仁香调，但伴有谷物、稻草、草本或干燥余味，与风味改变和整体品质下降相关。

五、讨论与结论

研究结果表明，酵母代谢在发酵过程中可修饰前体化合物，进而影响烘焙过程中的化学反应。c1t1处理（c1联合菌群在延滞期接种）有助于保留有机酸和风味前体，获得最高感官品质（82.63 SCA分）。c2t2处理（c2联合菌群在指数期接种）提高了黏液中醇类和酯类峰面积，并增加了烘焙咖啡中关键吡嗪类（2,5-二甲基吡嗪和2-甲基吡嗪）水平。尽管咖啡果品质变异影响黏液和烘焙咖啡的VOC谱，但本土酵母发酵剂培养物的使用可提供可靠的方法来标准化湿法发酵、降低风险，并在精品咖啡中开发特定风味特征。未来需要对酵母菌株进行更全面的研究以评估其局限性和潜力，并探究其对糖类、有机酸和氨基酸等其他化学家族的影响，以阐明其与咖啡成分的广泛关系。