工程化耐酸非常规酵母Pichia kudriavzevii E1重建胞质逆向β-氧化途径并挖掘LpTer用于丁酸生产

《Mycology》：Engineering acid-tolerant non-conventional yeast Pichia kudriavzevii E1 for butyric acid production

　　

丁酸是一种应用广泛的重要有机酸；然而，耐酸宿主稀缺制约了其微生物生产。在此，研究人员在耐酸非常规酵母Pichia kudriavzevii E1中建立了胞质逆向β-氧化（reverse β-oxidation）途径用于丁酸生产。研究人员评估了增强胞质乙酰辅酶A（acetyl-CoA）可利用性的策略，包括阻断乙醛酸循环（glyoxylate cycle）、过表达乙酰辅酶A合成酶（acetyl-CoA synthetase，ACS）、动员过氧化物酶体乙酰基单元（peroxisomal acetyl units）以及胞质表达丙酮酸脱氢酶复合体（pyruvate dehydrogenase complex，PDH）。PDH的胞质表达使丁酸产量提高1.7倍，凸显了乙酰辅酶A区室化的重要性。对途径酶的评价鉴定出反式烯酰辅酶A还原酶（trans-enoyl-CoA reductase，Ter）为潜在限速酶。研究人员从浓香型白酒窖泥宏基因组（strong-aroma Baijiu pit-mud metagenome）中鉴定出一种此前未表征的Ter酶，命名为LpTer。优化LpTer拷贝数和胞质NADH利用使丁酸滴度提高至339.07 ± 8.30 mg/L，较初始菌株提高约68倍。该研究通过途径优化和酶挖掘，首次系统工程化耐酸酵母P. kudriavzevii以实现无需pH调节的丁酸从头生产。

研究背景与问题：丁酸是四碳短链脂肪酸和重要平台化学品，广泛应用于食品、动物饲料、制药和化工行业。目前丁酸主要依赖石油化工来源的丁醛氧化制造；可再生化学品和健康促进产品的需求增长推动微生物合成受到关注。Clostridium tyrobutyricum虽为天然丁酸生产者，但严格厌氧和遗传操作困难限制其工程化；E. coli和Saccharomyces cerevisiae等可遗传操作宿主中已引入异源丁酸途径，但丁酸本身具有抑制性：未解离形式可穿过质膜并在胞内解离释放质子，酸化胞质、破坏质子动力势并抑制生长和产物形成。丁酸毒性与其pK_a（4.82）和发酵pH密切相关，近中性pH虽可降低抑制性游离酸浓度，却需持续加入NaOH、Ca(OH)₂或NH₄OH等中和碱，导致碱耗、产物成盐、碳源有效产率下降、无机阳离子增加和下游纯化复杂化。因此，需要一种在酸性条件下、最好无需pH中和剂即可维持丁酸生产的稳健且可遗传操作宿主。耐酸酵母Pichia kudriavzevii E1前期已被分离并建立CRISPR-Cas9基因组编辑系统，且已用于低pH有机酸生产；但其用于丁酸生物合成尚未被探索。逆向β-氧化（reverse β-oxidation）可直接将乙酰辅酶A（acetyl-CoA）经CoA依赖反应转化为丁酰辅酶A，避免常规脂肪酸合成中ATP依赖的丙二酰辅酶A形成，是合成还原性化学品的吸引途径；然而酵母中该途径高效运行仍受胞质乙酰辅酶A供给和途径酶限制。基于此，研究人员在P. kudriavzevii E1中重构异源逆向β-氧化途径，并围绕胞质乙酰辅酶A供给、限速酶鉴定与替换、宿主氧化还原调控和培养条件优化开展研究。研究最终建立耐酸酵母丁酸从头生产平台，初始菌株产5.0 ± 0.15 mg/L，最终滴度达339.07 ± 8.30 mg/L，较初始提高约68倍；该研究首次系统工程化P. kudriavzevii用于无需pH调节的丁酸生产，强调途径分析与酶挖掘结合的价值，并为利用耐酸宿主进一步提高滴度、得率和生产率提供理性基础。

关键技术方法（≤250字）：研究采用已建立的CRISPR-Cas9基因组编辑系统在P. kudriavzevii E1中进行基因组整合和启动子替换；以RT-qPCR检测异源基因转录；用乙酰辅酶A含量测定评估胞内acetyl-CoA；基于中国四川浓香型（strong-aroma）白酒窖泥宏基因组数据集，通过系统发育分析和Ter缺失株功能互补筛选候选Ter；以GC-MS确认丁酸形成，HPLC定量丁酸、葡萄糖、乙酸和乙醇；通过摇瓶发酵评价途径与培养条件。方法未涉及临床样本队列。

研究结果：3.1 构建P. kudriavzevii E1丁酸生物合成途径。研究人员先比较耐酸性，E1在含50 mmol/L丁酸、初始pH约3.5的SD培养基中保持稳健生长，而S. cerevisiae S288C不能存活；随后将五酶组成的异源逆向β-氧化途径整合至基因组，包括E. coli的乙酰辅酶A乙酰转移酶（acetyl-CoA acetyltransferase，AtoB）和酰基辅酶A硫酯酶（acyl-CoA thioesterase，TesB）、C. acetobutylicum的3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶（3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase，Hbd）和巴豆酸酶（crotonase，Crt）以及T. denticola的Ter。RT-qPCR显示五个异源基因在E1D06中均可转录，E101中未检出；E1D06经72 h摇瓶培养积累5.0 ± 0.15 mg/L丁酸，GC-MS确认丁酸峰与标准品保留时间和质谱一致，E101未检出丁酸，表明途径成功重构但滴度较低。3.2 工程化胞质乙酰辅酶A供给增强丁酸生物合成。乙酸添加从0增至40 mmol/L使丁酸由6.4 ± 0.3 mg/L增至16.4 ± 0.13 mg/L；单独删除MLS1或联合删除MLS1和ICL1未提高丁酸，反而略降；过表达ACS1或ACS1+ACS2、表达Cat2-PEX15或ScCat2-PEX15均未改善终滴度；胞质表达PDH（E1D11）显著提高丁酸至10.95 ± 0.22 mg/L，约为E1D06的1.70倍。E1D11生长与E1D06近乎相同，对数期12 h胞内acetyl-CoA较E1D06提高26.97%；在E101中表达同一PDH模块（E1D14）使acetyl-CoA提高29.72%。结论为胞质PDH可提高acetyl-CoA供给和丁酸滴度且不损害生长，前体区室化是关键瓶颈。3.3 鉴定Ter为途径限速步骤。分别增加AtoB、Hbd、Crt、Ter或TesB三拷贝，仅Ter三拷贝显著提高24、48和72 h丁酸生产；Ter额外一、二、三拷贝在72 h分别达20.73 ± 0.40、29.78 ± 0.21和36.84 ± 0.27 mg/L，约为E1D11（10.44 ± 0.30 mg/L）的2.0、2.9和3.5倍。结论为巴豆酰辅酶A（crotonyl-CoA）还原为丁酰辅酶A（butyryl-CoA）是主要催化瓶颈。3.4 筛选替代Ter提高丁酸生产。基于浓香型白酒窖泥宏基因组选择5个候选，先在Ter缺失株E1D05中测试，均不同程度恢复丁酸合成，5280-13最高为7.24 ± 0.19 mg/L；在E1D11中5280-13最高达35.43 ± 4.37 mg/L，显著高于原Ter；序列分析显示其与Lentilactobacillus parafarraginis的烯酰-酰基载体蛋白还原酶（enoyl-ACP reductase）高度相似，命名为LpTer。LpTer额外一、二、三拷贝中，二拷贝E1D33在72 h最高达123.38 ± 0.83 mg/L，三拷贝未继续提高且略降，故选择E1D33。3.5 微调NDE1表达提高丁酸生产。LpTer催化crotonyl-CoA至butyryl-CoA需NADH，NDE1编码参与胞质NADH氧化的外部线粒体NADH脱氢酶；用TDH3、PYC1、CCG6、IMB1和AIM3启动子控制NDE1表达，TDH3和PYC1降低丁酸，CCG6、IMB1和AIM3提高丁酸，AIM3最高E1D39达165.49 ± 6.59 mg/L。进一步在30、33、35 °C和初始葡萄糖40、60、80 g/L条件下评价，33 °C、60 g/L时E1D39在72 h最高达339.07 ± 8.30 mg/L。

讨论与结论：讨论指出，E1在初始pH 3.5、50 mmol/L丁酸中生长良好，与P. kudriavzevii适合低pH有机酸发酵的特性一致；初始5.0 ± 0.15 mg/L经前体供给优化、途径酶强化和氧化还原工程提高至339.07 ± 8.30 mg/L，约68倍。acetyl-CoA实验显示前体可利用性最初限制生产；胞质PDH优于ACS过表达、MLS1/ICL1删除和Cat2-PEX15动员，强调亚细胞定位；PDH伴随的NADH生成也可能有助于生产。Ter拷贝数增加逐步提高滴度，确认crotonyl-CoA还原为dominant催化约束；宏基因组筛选获得LpTer，其注释为enoyl-ACP reductase，原文指出细菌enoyl-ACP reductase可表现混杂的trans-enoyl-CoA reductase活性，体内互补支持其替代Ter；LpTer二拷贝最佳、三拷贝略降，原文指出表达负担、辅因子竞争或途径失衡可能抵消进一步催化能力，表明平衡表达比单一组分最大化更重要。NDE1启动子替换显示氧化还原工程需定量控制，弱启动子CCG6、IMB1、AIM3提高丁酸而强启动子TDH3、PYC1降低，原文提出“redox valve”模型，即部分抑制保留NADH供LpTer同时维持呼吸功能；严重扰动可能影响ATP生成和整体碳代谢。原文也指出，尽管约68倍提高显著，摇瓶滴度仍低于工程化S. cerevisiae约1.8 g/L及pH控制和补料分批下E. coli的12–33 g/L；但本研究是耐酸酵母丁酸生产的初始尝试。发酵产物中检测到甘油，提示胞质还原力可用但未被丁酸途径高效捕获，途径酶活性而非仅NADH供给仍是重要限制；转运工程、适应性进化和耐受基因工程可能有助于接近宿主阈值时维持生长。研究结论（译）：本研究证明在耐酸酵母P. kudriavzevii E1中生产丁酸具有可行性；所用工程策略由途径限制识别指导：通过胞质PDH表达改善acetyl-CoA可利用性，通过宏基因组指导发现LpTer解决Ter催化还原步骤的限制。这些发现强调途径分析与酶挖掘结合对改善微生物生产有价值，并为利用耐酸宿主进一步提高滴度、得率和生产率提供理性基础。