辐照后树突状细胞亚群保留关键免疫功能且抗肿瘤免疫并非严格依赖cDC1

《OncoImmunology》：Irradiated dendritic cell subsets retain key immune capabilities and anti-tumor immunity is not strictly dependent on cDC1

　　

摘要：放射治疗可通过调节肿瘤微环境增强抗肿瘤免疫。然而，其对作为关键抗原提呈细胞的树突状细胞（dendritic cells, DCs）的直接作用仍研究不足。尽管DCs被认为相对放射抵抗，但其照射后的功能能力存在争议且可能具有亚群依赖性。本研究系统分析了小鼠骨髓来源的常规1型树突状细胞（conventional type 1 DCs, cDC1s，在启动CD8+ T细胞介导的抗肿瘤免疫中发挥关键作用）、常规2型树突状细胞（conventional type 2 DCs, cDC2s）以及单核细胞来源树突状细胞（monocyte-derived DCs, MoDCs）的放射敏感性和照射后功能能力。照射后，研究人员评估了DC活力和表面标志物表达。为评价功能能力，研究人员以高静水压灭活肿瘤细胞联合佐剂poly I:C和α-CD40作为治疗性肿瘤疫苗的模型系统刺激DCs，并分析了DCs的吞噬活性、活化以及细胞因子/趋化因子分泌。DC放射敏感性强烈依赖于亚群和成熟状态，成熟DCs较其未成熟对应细胞表现出更高的放射抵抗性，其中未成熟cDC1s尤为敏感。尽管如此，存活DCs仍保留吞噬肿瘤细胞的能力，并在刺激后上调活化相关和迁移相关标志物及分泌细胞因子和趋化因子。在体内，放射免疫治疗促进DCs向肿瘤引流淋巴结迁移并诱导DC活化，表现为外周血中DC相关细胞因子浓度升高。在固定的放疗联合检查点抑制方案中，缺乏cDC1亚群的Batf3?/?小鼠肿瘤生长延迟基本得以保留。综上，照射并不消除DC功能，且放射免疫治疗中的抗肿瘤免疫并非严格需要cDC1s。

辐照后树突状细胞亚群功能完整性及其在放射免疫治疗中作用的系统研究

一、研究背景与问题提出

放射治疗（radiotherapy, RT）通过诱导免疫原性细胞死亡和危险信号招募免疫细胞来调节肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME），从而增强抗肿瘤免疫。然而，辐射对肿瘤局部常驻免疫细胞的直接影响研究尚不充分。淋巴细胞高度放射敏感且易于快速死亡，而树突状细胞（dendritic cells, DCs）等髓系细胞通常被认为相对放射抵抗。但存活并不等同于功能完整，现有数据存在矛盾，从活化增强到功能损伤均有报道。

DCs是高度异质性的细胞群体，具有特化的功能。常规1型树突状细胞（conventional type 1 DCs, cDC1s）对于交叉提呈肿瘤相关抗原给CD8⁺ T细胞至关重要，常规2型树突状细胞（conventional type 2 DCs, cDC2s）主要启动CD4⁺ T辅助细胞，浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid DCs, pDCs）可产生I型干扰素并表达细胞毒或免疫抑制分子，单核细胞来源树突状细胞（monocyte-derived DCs, MoDCs）则具有高度可塑性。尽管存在这种多样性，放射生物学研究历来依赖小鼠骨髓来源MoDCs或人外周血单核细胞分化MoDCs，因其体外易获得。目前尚无研究直接比较不同DC亚群的放射敏感性及照射后功能完整性，也少有研究比较不同成熟程度的DCs。

二、研究内容与主要结论

研究人员系统分析了cDC1、cDC2和MoDC亚型的体外放射敏感性和功能完整性。研究采用高静水压（high hydrostatic pressure, HHP）灭活肿瘤细胞联合佐剂（poly I:C和α-CD40）作为治疗性肿瘤疫苗模型，评估照射后DCs的表型、细胞因子分泌和吞噬能力。体内实验进一步研究了DCs在放射免疫治疗中的迁移和功能。

主要结论包括：DC放射敏感性强烈依赖于亚群和成熟状态，成熟DCs高度放射抵抗，而未成熟DCs尤其是cDC1s更易受照射影响；照射后存活的DCs仍保留吞噬能力、对刺激的表型反应性、迁移能力以及通过细胞因子和趋化因子分泌驱动炎症信号的能力；在固定的放疗联合检查点抑制方案中，Batf3^?/?小鼠（缺乏cDC1亚群）的肿瘤生长延迟基本保留，表明该治疗模式下的抗肿瘤免疫并非严格依赖cDC1s。

三、关键技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：基于不同细胞因子组合（Flt3L、GM-CSF+Flt3L、GM-CSF）的小鼠骨髓来源DC亚群分化体系；X射线照射（2、5、8 Gy）；高静水压（200或500 MPa，300秒）灭活肿瘤细胞制备抗原来源；流式细胞术分析细胞活力、表面标志物表达及吞噬能力；多重酶联免疫吸附试验（ELISA）和29重Meso Scale Discovery（MSD）检测细胞因子/趋化因子分泌；双侧B16-F10黑色素瘤和4T1乳腺癌小鼠模型评估体内疗效；Batf3^?/?基因敲除小鼠验证cDC1依赖性。研究使用249只小鼠，包括雌性BALB/cJRj、雄性C57BL/6NRj、C57BL/6J及B6.129S(C)-Batf3^tm/J小鼠。

四、研究结果

RT对DC活力和表面标志物表达具有亚群特异性影响

照射后，MHC-II高表达的cDC1s比例显著增加，该群体活力未显著降低。MoDCs的MHC-II高群体活力和比例均不受影响，而MHC-II低群体在8 Gy照射后活力略有但显著降低。相比之下，Flt3L-DCs中cDC1s及cDC1培养中MHC-II低群体的活力在照射后显著降低。这些数据表明cDC1s尤其是未成熟亚群是这些DC亚群中最放射敏感的。

照射还诱导了亚群和剂量依赖的表面标志物上调。CD80在MHC-II低MoDCs和MHC-II低cDC1s以及Flt3L培养来源的cDC2s中显著增加。CD86、CD40和CCR7的显著上调仅限于Flt3L来源的DC培养，其中cDC1和cDC2亚群在5 Gy和8 Gy照射后均表现出这些标志物表达增加。在免疫调节分子方面，Flt3L分化DCs中PD-L1在cDC1和cDC2中显著上调（8 Gy），而Galectin-9（5 Gy）和BTLA表达（5 Gy和8 Gy）在cDC1中显著降低。

HHP灭活肿瘤细胞联合佐剂可激活DC亚群

在未照射条件下，佐剂单独或联合HHP灭活肿瘤细胞刺激后，cDC1s和MoDCs的MHC-II表达增加，大多数细胞呈现MHC-II高表型。佐剂联合HHP灭活肿瘤细胞显著增加了cDC1培养中CD80、CD86、CD40、CCR7、PD-L1和BTLA的表达。在Flt3L-DCs中，cDC1和cDC2对相同刺激均表现出CD80、CD86、CD40和CCR7表达增加，而MoDCs中CD86、PD-L1和galectin-9表达增加。仅HHP灭活肿瘤细胞刺激不显著影响任何亚群的表面标志物表达。

辐照DCs保留吞噬能力并对刺激保持表型反应性

尽管在较高剂量照射后，Flt3L-DCs中cDC1s和cDC1培养中MHC-II低群体的吞噬能力显著降低，但仍有高比例细胞表现出吞噬能力。所有其他受照射DC群体吞噬肿瘤物质的能力不受影响。在8 Gy照射后，cDC1s经肿瘤细胞和佐剂活化后CD80、CD86和CD40表达显著降低，但其他亚群不受照射负面影响。这些发现表明受照射DCs不仅维持抗原摄取，还保留对刺激的表型反应性。

照射对活化诱导的细胞因子和趋化因子分泌有负面影响但未完全消除

在cDC1和Flt3L培养中，增加辐射剂量显著降低了每存活细胞的IFN-β分泌，但该浓度仍高于相应未刺激组。其他趋化因子和IL-12的刺激诱导分泌在任何培养中均不受照射影响。这些发现表明，在大多数情况下，照射不影响存活DCs响应刺激分泌可溶性介质的能力，即使有影响也不会完全消除反应。

佐剂促进DCs向肿瘤引流淋巴结迁移并在体内活化

在双侧B16黑色素瘤模型中，放疗联合免疫检查点抑制剂（α-CTLA）基础上，疫苗接种后24小时，佐剂单独及联合HHP灭活肿瘤细胞处理组的肿瘤浸润cDC1和cDC2显著减少。疫苗接种后4天，佐剂单独及联合HHP灭活肿瘤细胞处理组小鼠的肿瘤引流淋巴结（dLN）中出现cDC2s积聚，随后CD80和PD-L1表达显著升高，而cDC1s表现出更高活化但数量未增加。除MCP-1和MIP-1α外，所有分析的趋化因子和细胞因子在佐剂处理组第4天血浆中显著升高。第14天，含佐剂组原发和远隔dLN中效应CD8⁺ T细胞频率均升高，远隔肿瘤中也观察到CD8⁺ T细胞频率增加。

cDC1s并非该治疗模式中抗肿瘤免疫的关键细胞

在Batf3^?/?小鼠（缺乏cDC1）和野生型对照中，除RT+ICI+HHP+Adj组的远隔肿瘤生长外，原发和远隔肿瘤生长在几乎所有情况下均因RT联合ICI和佐剂（单独或联合HHP灭活肿瘤细胞）而显著延迟。最重要的是，除RT+ICI+HHP+Adj组远隔肿瘤生长外，野生型和Batf3^?/?小鼠之间的肿瘤生长无显著差异，表明该治疗效应基本不依赖cDC1s。

五、讨论与结论

讨论总结

成熟DC亚群具有放射抵抗性且不受照射负面影响。成熟DCs可能通过过表达抗凋亡因子Bcl-XL、更高的双链断裂和碱基切除修复能力以及表达clusterin（防止活性氧介导的死亡）来获得更高的放射抵抗性。照射主要影响未成熟DCs的活力并调节其表面标志物表达。

受照射DCs仍可被激活并保持功能。照射前处理仅轻微降低MHC-II低cDC1s的吞噬百分比，且即使8 Gy剂量后Flt3L培养中大多数cDC1仍表现出吞噬活性。仅cDC1s在8 Gy照射并联合HHP灭活肿瘤细胞和佐剂刺激后表现出CD80、CD86和CD40表达降低，但表达水平仍远高于未刺激cDC1。照射未损害大多数蛋白质的刺激诱导分泌，仅cDC1和Flt3L培养中佐剂诱导的IFN-β分泌显著降低。

放射免疫治疗促进DC活化并独立于cDC1s实现肿瘤控制。放疗后联合佐剂和HHP灭活肿瘤细胞疫苗接种降低了肿瘤中cDC1和cDC2数量，但仅cDC2在肿瘤dLN中优先活化和积聚。外周血中多种炎症介质浓度升高，包括CXCL9、CXCL10、IL-12和IFN-γ，提示干扰素相关炎症环境支持DC活化和T细胞招募。Batf3^?/?小鼠中肿瘤生长控制得以保留，表明非cDC1亚群能够维持启动功能。

研究人员指出，单细胞研究已开始重新定义cDC1和cDC2在肿瘤中的功能二分法。成熟DCs富集免疫调节分子（mregDC）状态可从cDC1和cDC2谱系产生，与本研究中共刺激和共抑制分子跨亚群同时上调的表型数据一致。研究结果与某些模型中cDC1依赖性结论的差异可能反映肿瘤模型、放疗和检查点抑制方案或疫苗佐剂策略的差异。研究设计存在一定局限性，包括放疗在所有组中保持恒定、Batf3^?/?为组成型敲除可能存在发育补偿、T细胞分析与DC分析时间点不同等。

结论翻译

DC的放射敏感性强烈依赖于其亚群和成熟状态。成熟DCs高度放射抵抗，而未成熟DCs尤其是cDC1s更易受照射影响。重要的是，尽管经过预先照射，存活DCs在其吞噬能力、对微环境信号的响应、迁移以及通过细胞因子和趋化因子分泌驱动炎症信号方面仍保持功能。这支持了受照射肿瘤微环境中DCs积极参与辐射诱导的抗肿瘤免疫的概念。此外，在固定的放疗和检查点抑制骨干方案中，研究结果挑战了该放射免疫治疗背景下cDC1依赖性的范式，表明有效的抗肿瘤免疫可以在其他DC亚群的主要贡献下实现。总之，这些发现凸显了DC亚群在放射免疫治疗中对抗肿瘤免疫贡献的适应性本质。