唾液酸顺式配体（cis-ligands）作为Siglec功能调节因子在肿瘤免疫中的作用

《OncoImmunology》：Sialic acid cis-ligands as modulators of Siglec function in cancer immunity

　　

Siglec-唾液酸聚糖（sialoglycan）轴是癌症中新兴的糖免疫检查点，其依据是肿瘤微环境（TME）中Siglec与唾液酸聚糖的频繁上调。Siglec是表达于免疫细胞表面的受体，可识别以唾液酸（sialic acid）末端修饰的糖类结构——唾液酸聚糖。Siglec受体家族的大多数成员为抑制性受体，通过招募含Src同源2结构域（SH2）的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2抑制免疫细胞活化。免疫细胞表达的Siglec可与肿瘤细胞及基质细胞等其它细胞上的配体结合（反式相互作用，trans-interactions），这一点已被充分证实。然而，免疫细胞自身亦表达唾液酸聚糖，可作为同一细胞表面Siglec的配体（顺式相互作用，cis-interactions）。过去二十年间，大量研究探讨了Siglec反式结合如何促进肿瘤微环境中的免疫抑制。然而，对于大多数Siglec家族成员而言，顺式相互作用在调控Siglec功能及影响免疫细胞活性中的作用仍属研究不足的领域。本综述讨论顺式配体如何调节Siglec功能、免疫细胞表面唾液酸表达的调控机制，以及免疫细胞所表达的顺式相互作用在肿瘤微环境中的功能相关性。深入理解上述过程可能有助于开发靶向癌症中Siglec-唾液酸聚糖轴的下一代治疗策略。

引言

唾液酸聚糖是一类以带负电荷的唾液酸残基为末端的糖类结构，几乎表达于所有哺乳动物细胞表面，是糖萼的重要组成部分，在细胞黏附、细胞信号传导和免疫应答中发挥关键作用。唾液酸聚糖构成多种糖结合蛋白的配体，包括唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（Siglecs）、选择素（selectins）和补体因子H（factor H）。本综述聚焦于表达于固有免疫和适应性免疫细胞上的Siglec受体。人Siglec受体家族包含14个成员，其中大多数为抑制性受体，胞内含有免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）及ITIM样基序。当这些受体识别唾液酸时，其ITIM/ITIM样结构域发生磷酸化，从而招募含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2；随后这些磷酸酶使下游信号分子去磷酸化，最终抑制免疫细胞活化。Siglec-唾液酸聚糖轴已成为癌症中一种新型糖免疫检查点，其驱动因素在于多种肿瘤类型中免疫细胞上Siglec受体以及肿瘤和基质细胞上唾液酸聚糖在肿瘤微环境（TME）中的频繁上调。肿瘤细胞唾液酸聚糖表达增加可能源于唾液酸转移酶（催化唾液酸分子转移至糖链的酶）表达改变和/或内源性唾液酸酶（sialidases，可切除唾液酸）的下调。过去二十年间，大量研究阐明了Siglec-唾液酸聚糖轴在TME中驱动免疫抑制的机制：在髓系细胞中，Siglec-7、-9和-15诱导促肿瘤免疫表型并妨碍有效的T细胞致敏；此外，巨噬细胞上的Siglec-9和-10参与抑制肿瘤细胞吞噬。在自然杀伤（NK）细胞中，Siglec-7和-9在肿瘤共培养体系中抑制其细胞毒性和脱颗粒能力。T细胞通常不表达Siglec受体，但其表达可在TME中被诱导。因此，旨在破坏癌症中Siglec-唾液酸聚糖轴的治疗策略正被积极探索，包括靶向Siglec的抗体、基于唾液酸酶的方法以及代谢性唾液酸化抑制剂。目前临床应用的免疫检查点抑制剂主要靶向T细胞介导的蛋白-蛋白相互作用，仅使部分患者获益；更广泛地靶向多种免疫细胞群体间的蛋白-糖相互作用可能增强抗肿瘤免疫，尤其是对现有获批免疫检查点疗法无应答的患者。

尽管近年来研究Siglec-唾液酸聚糖轴在肿瘤免疫学中作用的研究数量有所增加，但这些研究主要聚焦于免疫细胞上Siglec与其它细胞（即肿瘤或基质细胞）上唾液酸聚糖之间的反式相互作用。免疫细胞自身亦表达唾液酸聚糖，可与同一细胞表面的Siglec受体顺式结合。关于免疫细胞上这些顺式配体如何影响Siglec功能及免疫细胞活性，在Siglec-2中研究最为深入。然而，对于其它Siglec家族成员，Siglec-唾液酸聚糖顺式相互作用在TME中的作用仍相对缺乏探讨。因此，本综述将重点阐述：（1）顺式配体调控Siglec功能的机制；（2）免疫细胞上唾液酸水平的调节方式；（3）这些顺式配体在TME中的作用。

免疫细胞上的顺式配体调节Siglec功能

顺式配体调控Siglec用于反式相互作用的可及性

免疫细胞的去唾液酸化（desialylation）可暴露Siglec受体，表明免疫细胞表达的顺式配体限制了Siglec与肿瘤细胞等进行反式结合的可及性。这些暴露效应具有Siglec和免疫亚群特异性；例如，Siglec-7和-9在人NK细胞上似乎被遮蔽，而单核细胞上仅Siglec-7被遮蔽。与此一致，通过突变胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸合成酶（CMAS）对唾液酸生物合成进行遗传学干扰，可增强U937单核细胞中Siglec-7的反式结合，并增强其对Fcγ受体（FcγR）信号的抑制作用。研究人员利用嵌合Siglec-7和-9的Jurkat/MA报告细胞证实，顺式相互作用限制了肿瘤细胞诱导的Siglec反式信号传导。这一观察得到多项原代人NK细胞研究的支持，这些研究表明，去除NK细胞上的唾液酸是揭示Siglec-7和/或-9介导的肿瘤细胞细胞毒性抑制作用所必需的。图1展示了免疫细胞上的唾液酸顺式配体调节Siglec功能：顺式配体调控Siglec受体参与反式相互作用的可及性（A）；与抑制性Siglec的顺式结合可能诱导基础性免疫抑制信号（B）；顺式配体影响Siglec的膜组织分布，从而可能影响SHP-1动力学和/或其与活化受体的空间邻近性（C）；上述顺式配体介导的机制共同可能精细调节免疫细胞的活化阈值。

尽管免疫细胞上的顺式配体限制了Siglec与肿瘤细胞反式相互作用的可及性，但该限制可被高亲和力反式配体克服。顺式与反式结合的平衡可能取决于可用配体的性质及相对亲和力。例如，肿瘤细胞上密集聚集的CD43（Siglec-7的特异性配体）即使在顺式配体存在时也能驱动Siglec-7结合。具体而言，当过表达Siglec-7的NK92-MI细胞与表达内源性CD43水平的野生型（WT）K562细胞共培养时，Siglec-7依赖性的NK细胞细胞毒性抑制缺失，但当CD43在K562细胞中过表达时则该抑制作用显现。类似原则适用于其它Siglec家族成员。Siglec-2在B细胞上通过与α2-6唾液酸化N-聚糖的顺式相互作用而被遮蔽，但这些顺式相互作用并不阻止该受体与其它细胞或合成支架上呈递的反式配体结合。例如，Siglec-2向淋巴细胞簇接触部位的重定位不依赖于顺式配体表达。此外，表达较低亲和力顺式配体的生发中心（GC）B细胞中Siglec-2的反式结合强于表达较高亲和力顺式配体的初始和记忆B细胞。总之，现有证据支持如下模型：Siglec反式结合的程度由免疫细胞上的顺式遮蔽与其它细胞（如肿瘤、基质或其它免疫细胞）上可用反式配体的亲和力和密度之间的动态平衡所决定。

Siglec顺式结合可能诱导基础性抑制信号

除调节Siglec受体用于反式结合的可及性外，免疫细胞上的顺式相互作用还可能通过诱导基础性抑制信号促进免疫稳态。这一概念得到多项髓系细胞研究的支持。例如，分别将Siglec-2、-3或-9的顺式配体插入小鼠小胶质细胞、人单核细胞或人巨噬细胞膜中后，吞噬作用以Siglec依赖的方式降低。除吞噬能力外，免疫细胞上顺式配体的存在似乎也损害炎性细胞因子的产生。在人原代单核细胞中，提供Siglec-3反式配体可降低白介素（IL）-1β的产生，而沉默Siglec-3或细胞去唾液酸化则增强IL-1β的产生。尽管该发现与Siglec-3顺式配体在调节炎性细胞因子产生中的抑制作用一致，但去唾液酸化除去除顺式配体之外的其他效应也可能促成所观察到的反应，值得进一步研究。Delaveris等采用更具顺式配体特异性的方法，利用合成脂质连接糖多肽将Siglec-9顺式配体植入巨噬细胞膜，结果降低了脂多糖（LPS）刺激的THP-1巨噬细胞产生IL-1β、IL-8和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。此外，Siglec-9顺式配体抑制中性粒细胞NETosis，并可能减弱肥大细胞活化。总之，这些研究提供证据表明，实验性增加Siglec顺式配体可削弱免疫细胞活化。然而，内源性顺式配体在生理条件下对基础性抑制信号的贡献程度仍不甚明确。

顺式配体的作用可能超越维持静息状态下的免疫稳态，因为免疫活化过程中顺式配体表达的动态变化也可调节Siglec功能。研究人员此前假设，免疫细胞活化后顺式配体的下调（如在原代人NK细胞中观察到的）可能增加Siglec受体用于反式结合（如与肿瘤、基质或其它免疫细胞）的可及性。这种增强的反式相互作用随后可能促进免疫抑制性Siglec信号，从而建立限制持续免疫应答的负反馈机制。然而，尚需进一步研究以阐明顺式配体表达变化如何影响免疫细胞活化和Siglec功能。

免疫细胞上的顺式相互作用调节Siglec的膜分布

免疫细胞上顺式配体调节Siglec功能的另一机制是影响Siglec的膜分布及其与活化受体（如B细胞受体（BCR）或Toll样受体（TLRs））的相互作用。这一概念在B细胞上的Siglec-2中描述最为充分。Siglec-2可与其他Siglec-2分子发生同源多聚体相互作用，并与CD45、IgM和β7整合素等多种细胞蛋白发生异型相互作用，至少部分以唾液酸依赖的方式。这些Siglec-2顺式相互作用在调节Siglec-2介导的BCR抑制中发挥关键作用。在抗IgM刺激的B细胞中，当Siglec-2顺式相互作用被破坏时，Siglec-2对BCR的抑制增强。这见于表达R突变体Siglec-2（缺乏唾液酸识别所必需的必需精氨酸）的B细胞、缺乏生成Siglec-2顺式配体所必需的唾液酸转移酶St6gal1的B细胞，以及经唾液酸苷（sialoside）处理以阻止Siglec-2顺式相互作用的B细胞。此外，在St6gal1缺陷和Siglec-2 R突变B细胞中，可观察到Siglec-2与BCR共定位增强。Gasparrini等表明，B细胞上的顺式配体促进Siglec-2组织成纳米簇，使Siglec-2远离BCR；他们提出，Siglec-2顺式相互作用的消除导致Siglec-2迁移性增高，随后与BCR共定位增加，从而增强BCR抑制。另一框架认为，SHP-1而非Siglec-2迁移性对解释Siglec-2顺式配体破坏对BCR信号的影响至关重要。当Siglec-2组织成簇且高度磷酸化时，SHP-1可使邻近的Siglec-2去磷酸化。B细胞上Siglec-2顺式相互作用的消除将导致较小的Siglec-2簇，随后SHP-1介导的Siglec-2去磷酸化降低，从而增强Siglec-2诱导的BCR抑制。由于Siglec-2仅在BCR连接的B细胞中高度磷酸化，而在静息B细胞中并非如此，该模型解释了为何干扰顺式配体结合可降低抗IgM刺激B细胞中的BCR信号，而在静息B细胞中则不然。事实上，在静息B细胞中，通过应用高亲和力唾液酸苷破坏顺式配体结合会增加稳态信号，可能是通过扰动B细胞上的Siglec-2/BCR顺式相互作用。Siglec-2并非B细胞表达的唯一Siglec；它们还表达Siglec-10，在小鼠B细胞中则为Siglec-G。与Siglec-2类似，Siglec-G以顺式配体依赖的方式与BCR结合。表达R突变体Siglec-G（不能结合唾液酸因而缺乏顺式相互作用）的鼠B1a细胞在BCR连接后显示钙信号增强。这支持Siglec-G与BCR之间的顺式相互作用促进Siglec-G介导的BCR信号抑制这一观点。总之，顺式相互作用影响B细胞上Siglec-2和Siglec-G的空间组织和膜分布，从而塑造其调节BCR信号的能力。

除与BCR相互作用外，已有报道若干Siglec与TLR发生顺式结合。然而，Siglec-E/TLR4顺式相互作用的功能相关性仍存争议。早期研究提示，Siglec-E（Siglec-9的小鼠直系同源物）与TLR4顺式结合，促进TLR4内吞。然而，后续报道将Siglec-E的抑制作用主要归因于反式结合，对Siglec-E/TLR4顺式相互作用的重要性提出质疑。涉及病原体的研究可为进一步理解Siglec/TLR顺式相互作用提供线索。例如，肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）表达唾液酸酶，可使髓系细胞去唾液酸化。值得注意的是，感染该细菌还诱导TLR2去唾液酸化，从而减弱Siglec-5与TLR2之间的相互作用；该降低随后减少抑制性Siglec受体对SHP-1的招募，导致THP-1细胞炎症反应增强和细胞毒性增加。除直接的Siglec/TLR相互作用外，据报道Siglec-3与CD14（TLR4的共受体）发生顺式结合，进而负向影响TLR4信号。总之，免疫细胞上的顺式配体可改变Siglec的膜分布及其与免疫活化受体（如BCR和TLRs）的结合。尽管Siglec-2顺式配体被描述为调节Siglec-2受体成簇、迁移性和SHP-1动力学，但迄今对CD33相关Siglec的研究主要涉及顺式相互作用在形成与固有免疫受体（或Siglec-G情形下与BCR）的受体复合物中的作用。Siglec-2所描述的顺式配体依赖性机制在多大程度上同样适用于CD33相关Siglec仍基本未知。解决该问题对于理解顺式相互作用如何调节TME中免疫细胞内的Siglec功能具有重要意义。

顺式配体作为免疫细胞活性的情境依赖性调节因子

现有证据提示，顺式配体可能不仅是Siglec的被动遮蔽物，而是Siglec功能和免疫细胞活性的情境依赖性调节因子。初看之下，所报道的顺式配体效应似乎相互矛盾。顺式配体既可遮蔽Siglec并限制其用于反式相互作用的可及性，也与Siglec受体的顺式结合所介导的基础性免疫抑制有关。此外，顺式配体影响Siglec的空间组织，这可能促进或限制Siglec介导的对免疫活化通路的抑制。然而，这些机制可能并非相互排斥，其相对贡献可能取决于细胞和环境情境，包括可用顺式和反式配体的丰度、分布和亲和力。研究人员假设，在生理条件下，顺式配体有助于设定免疫细胞的活化阈值；而在癌症等病理环境中，其相对贡献可能因Siglec受体及其配体表达的改变而发生变化（如“顺式配体在肿瘤微环境中的作用”一节所述）。研究顺式配体相互作用工具的进一步进展将有助于阐明其生理意义。

研究顺式配体的复杂性

研究顺式配体对免疫细胞中Siglec功能的影响仍是糖生物学领域的一项挑战，因为现有工具往往对顺式配体不具特异性。因此，实验方法常常同时影响顺式和反式相互作用，难以将观察到的效应特异地归因于顺式配体结合的变化。此外，许多此类方法诱导的广泛细胞变化超出对Siglec顺式配体的调节。

例如，采用唾液酸酶或唾液酸模拟物（sialic acid mimetics）进行全局性唾液酸去除，常用于破坏Siglec顺式配体。然而，该方法也影响依赖于细胞表面唾液酸化的其它生物学过程，使对所得表型的解释复杂化。在人及小鼠树突状细胞（DCs）中，唾液酸模拟物处理增强TLR介导的成熟及其活化T细胞的能力。后一效应至少部分可归因于去唾液酸化后DC-T细胞结合亲合力增加及CD80-CD28共刺激相互作用增强，而非仅归因于Siglec顺式相互作用的改变。此外，去除唾液酸影响细胞表面电荷，并可能影响受体功能，因为多种受体的配体结合和稳定性依赖于唾液酸化。研究免疫细胞顺式配体的其它方法也存在挑战。将合成脂质偶联的Siglec结合配体引入细胞膜或过表达特定唾液酸转移酶，通常导致呈递单一高亲和力顺式配体，这不太可能反映免疫细胞上顺式配体的天然多样性。同样，对唾液酸生物合成途径的遗传操作可能影响顺式配体表达以外的细胞过程。例如，Cmas缺陷淋巴细胞缺乏唾液酸化配体，但也显示caspase-3活化增加和存活受损。最后，实验培养条件可能进一步使解释复杂化。胎牛血清含有N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc），这是一种唾液酸家族成员，尽管人细胞不能内源性合成，但可将其掺入。由于Neu5Gc可作为Siglec配体，其在培养条件中的丰度可能导致体外非生理性的顺式配体呈递或Siglec的非预期反式结合。总之，上述观察凸显了现有实验方法固有的局限性，并强调需要谨慎解释旨在确定Siglec顺式配体作用的研究。

调节免疫细胞上唾液酸顺式配体表达的因素

鉴于顺式配体在调节Siglec功能中的作用，一个关键问题是哪些因素控制其在免疫细胞上的表达。唾液酸聚糖水平在分化和活化过程中受到动态调节（图2）。这些变化可在多个层面进行评估，包括唾液酸转移酶和唾液酸酶的表达，以及总唾液酸和细胞表面相关唾液酸的丰度（例如通过质谱或流式细胞术）。这些指标共同为免疫细胞中唾液酸聚糖表达如何被调控提供互补性见解。图2提出免疫细胞活化过程中唾液酸聚糖顺式配体重塑的模型：髓系细胞（左图）在分化和成熟过程中经历唾液酸化谱的广泛重塑，其特征为唾液酸转移酶表达改变和神经氨酸酶活性增加（1）；这些变化理论上也可能降低顺式配体丰度，可能暴露Siglec受体（2）；髓系细胞去唾液酸化与效应功能增强相关（3）。淋巴样细胞（右图）活化改变顺式配体表达，可能导致Siglec暴露（4）或Siglec在细胞膜上重分布（5）；这些变化理论上可能改变Siglec与活化受体的结合并增强其用于反式相互作用的可及性。图中提出的活化相关顺式配体表达改变为工作模型，尚需进一步实验验证。

髓系细胞

单核细胞可分化为多种亚群，即巨噬细胞和DCs，并响应环境线索进一步成熟。为研究分化和成熟如何影响唾液酸含量，多数研究依赖体外模型，如佛波酯（PMA）分化的THP-1巨噬细胞样细胞和单核细胞衍生的DCs。巨噬细胞和DCs的分化涉及神经氨酸酶和唾液酸转移酶表达的改变。在这两种髓系亚群中，神经氨酸酶（特别是神经氨酸酶1和/或-3）的基因表达和酶活性均升高。然而，巨噬细胞分化对唾液酸转移酶表达和总体唾液酸聚糖水平的影响在不同研究间差异较大。未成熟DCs尽管在分化过程中神经氨酸酶活性增加，但由于多种唾液酸转移酶（包括ST6GAL1、ST3GAL1和ST3GAL4）表达上调而高表达唾液酸。此外，DCs表现出细胞表面唾液酸转移酶催化活性，这可能有助于分化过程中细胞表面唾液酸聚糖的快速重塑。关于成熟，大多数DCs研究显示唾液酸聚糖下调，尤其是α2-6唾液酸聚糖。相应地，DC去唾液酸化——无论通过唾液酸酶酶处理、唾液酸转移酶基因失活还是代谢性唾液酸阻断——均可诱导通常与更成熟表型相关的细胞特性，包括内吞能力降低、主要组织相容性复合体（MHC）-I/II和共刺激分子表达增高、IL-12产生上调以及更强的T细胞活化潜能。在巨噬细胞中，去唾液酸化也与关键效应功能相关。抑制神经氨酸酶1导致促炎细胞因子分泌减少、吞噬作用降低和FcγR信号受损。此外，与IL-4和IL-13诱导的抗炎巨噬细胞相比，LPS和/或IFN-γ诱导的促炎巨噬细胞（人moMac、人THP-1和小鼠RAW264.7巨噬细胞）上α2-6细胞表面唾液酸化较低。总之，这些研究表明髓系细胞分化和成熟伴随唾液酸化的动态变化，而去唾液酸化与效应功能的获得相关。这些变化是否转化为Siglec顺式配体表达的改变仍基本未被探索，是未来研究的一个令人关注的途径。此外，近期一篇综述对DC唾液酸化进行了更详细的讨论。

淋巴样细胞

NK细胞成熟时下调其CD56表达，从CD56^bright转变为细胞毒性更强的CD56^dim细胞。该转变与膜上唾液酸的下调相吻合，这在健康及肥胖个体的NK细胞中均有测定。有趣的是，Siglec-7受体细胞表面密度在CD56^dim NK细胞上更高，而Siglec-7⁺细胞的百分比在CD56^bright和CD56^dim NK细胞之间相似。对于Siglec-9，CD56^dim NK细胞的细胞表面受体密度和Siglec-9⁺细胞百分比均高于CD56^bright NK细胞。由于Siglec活化涉及受体成簇，可推测成熟CD56^dim NK细胞上较高的Siglec受体密度可能促进该过程；同时，顺式配体可及性降低可能增强NK细胞上Siglec的可及性，理论上进一步有利于肿瘤或基质细胞介导的反式Siglec活化。转向使用细胞因子活化NK细胞，现有证据指向Siglec顺式配体下调。例如，NK-92细胞系过夜IL-2刺激降低ST3GAL1、ST6GAL1和ST8SIA1基因表达；后者反映为神经节苷脂GD3（Siglec-7的著名配体）细胞表面表达降低。IL-2刺激后GD3下调可能提示Siglec-7受体暴露，但尚需实验验证。相应地，原代人NK细胞经IL-2或IFN-α过夜刺激或IL-2/IL-15诱导增殖后，Siglec-7和Siglec-9顺式配体下调。如NK细胞成熟所述，NK细胞活化和增殖后Siglec-7和-9顺式配体的下调理论上可能使这些受体更易与肿瘤细胞发生反式Siglec结合。T细胞在正常条件下很少表达Siglec，但Siglec-7、-9和-10受体可在活化T细胞上或TME中获得，可能实现顺式相互作用。进入肿瘤后Siglec受体表达的诱导是否与T细胞上Siglec顺式配体调节同时发生仍有待阐明。然而，在健康原代人T细胞中，近期研究了T细胞分化和扩增对Siglec-7和-9配体表达的影响。关于T细胞分化，记忆CD4⁺ T细胞上Siglec-7配体表达低于初始CD4⁺ T细胞；在记忆CD4⁺ T细胞中，Th2和Th17细胞表面Siglec-7配体少于Th1细胞。有趣的是，IL-2、抗CD3和抗CD28抗体诱导的T细胞扩增后Siglec-7配体也下调，但Siglec-9配体上调。在抗CD3/CD28活化的鼠T细胞中，Siglec-1、-F和-E配体总体增加，而Siglec-2配体表达下降，与T细胞活化时从Neu5Gc向Neu5Ac唾液酸表达的转变一致。这些研究凸显了T细胞活化和分化后Siglec配体水平的物种特异性和Siglec特异性变化。这些改变是否影响Siglec顺式结合尚需在表达Siglec的T细胞中进一步研究。B细胞在GC中经历体细胞超突变和类别转换突变，最终分化为分泌抗体的浆细胞或记忆B细胞。有趣的是，小鼠和人B细胞在该GC反应过程中均下调其高亲和力Siglec-2顺式配体，暂时暴露抑制性Siglec-2受体以进行反式相互作用，或允许Siglec-2与BCR顺式结合。在人中，GC B细胞丢失α2-6唾液酸化聚糖上的6-O-硫酸化GlcNAc修饰，导致较低亲和力的Siglec-2顺式配体。在小鼠中，GC B细胞下调胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶（CMAH），导致含Neu5Gc的高亲和力Siglec-2顺式配体丢失。高亲和力Siglec-2顺式配体的持续表达以及Siglec-2的缺失，均导致GC B细胞凋亡率升高、GC浆细胞和记忆B细胞输出减少。GC反应期间高亲和力Siglec-2顺式配体的丢失可能允许更强的Siglec-2/BCR顺式结合及随后的抑制信号，从而防止BCR过度活化并促进有效的GC应答。或者，GC中向低亲和力顺式配体的转变可能影响Siglec-2的反式结合。这与近期一项研究一致，该研究报道表达分别源自WT或Cmah缺陷小鼠的高或低亲和力顺式配体的B细胞之间，Siglec-2介导的BCR抑制无差异；然而，尚需在B细胞特异性Cmah缺陷小鼠中加以证实。尽管高亲和力顺式配体下调塑造GC中Siglec-2功能的精确机制仍有待完全阐明，现有证据清楚表明Siglec-2顺式配体调节GC动态并塑造B细胞分化。转向Siglec-G，据报道GC B细胞下调其Siglec-G顺式配体表达，而滤泡辅助性T细胞上配体表达增加。这种配体可及性的相互变化提示GC应答期间可能从顺式向反式Siglec-G结合转变。总之，NK细胞和B细胞研究表明，活化和分化伴随Siglec配体表达的改变，这可能影响Siglec用于顺式或反式相互作用的可及性。与髓系细胞研究多集中于总体唾液酸化变化不同，淋巴样细胞研究更常检测单个Siglec受体的配体。尽管T细胞中Siglec配体表达的变化也已被描述，但其对顺式配体调节的相关性仍不确定，因为T细胞在生理条件下很少表达Siglec。

顺式配体在肿瘤微环境中的作用

TME是由恶性细胞、基质细胞、内皮细胞和免疫细胞组成的复杂生态系统。鉴于免疫细胞上唾液酸聚糖的动态调节及其作为Siglec顺式配体的潜能，进一步深入了解这些顺式配体在TME中的作用可增进对Siglec-唾液酸聚糖轴如何影响抗肿瘤免疫的理解。在大多数（但并非所有）体内肿瘤模型中，TME去唾液酸化可延缓肿瘤生长并提高生存率。部分研究特异性靶向肿瘤细胞唾液酸化，例如通过敲除肿瘤细胞系中参与唾液酸生物合成或转运的关键酶。其它方法，如肿瘤导向的唾液酸酶和唾液酸模拟物，可能影响TME中的多种细胞类型，因而也可能破坏免疫细胞上的Siglec顺式相互作用。与此观点一致，若干研究报道除肿瘤细胞外，免疫细胞亚群也发生去唾液酸化。例如，在B16-F10黑色素瘤模型中瘤内注射唾液酸模拟物可降低肿瘤细胞和免疫细胞上α2-3和α2-6唾液酸聚糖表达，并促进更为免疫允许的TME，其特征为效应细胞浸润增强和T细胞细胞毒性增强。同样，在HER2阳性三阴性乳腺癌小鼠模型中，采用曲妥珠单抗-唾液酸酶构建体治疗后观察到多种免疫亚群的去唾液酸化。值得注意的是，肿瘤相关巨噬细胞特异性敲除Siglec-E可降低唾液酸酶构建体的治疗获益，凸显TME唾液酸化与Siglec-E相互作用在肿瘤免疫逃逸中的潜在作用。除这些治疗方法外，缺乏宿主细胞上St8sia6依赖性Siglec-E配体的St8sia6缺陷小鼠，在接种B16、B16-OVA或MC38肿瘤细胞后，与WT小鼠相比表现出增强的抗肿瘤免疫。过继转移研究将该效应归因于髓系细胞上St8sia6的缺失。由于这些髓系细胞同时表达Siglec-E及其配体，Siglec-E顺式结合可能促进TME中的免疫抑制；然而，包括反式相互作用和Siglec非依赖效应在内的其它因素也可能起作用，值得进一步验证。尽管在体内难以厘清肿瘤细胞与免疫细胞去唾液酸化的相对贡献，一项体外共培养模型提示肿瘤细胞去唾液酸化通过增强MHC-I抗原呈递在促进DC成熟和CD8⁺ T细胞活化中发挥更显著作用。尽管具有启发性，这些简化系统可能无法完全反映TME的复杂性，凸显在更接近天然TME的模型中验证这些观察的价值。

总之，多项体内研究表明去唾液酸化增强抗肿瘤免疫应答。值得注意的是，唾液酸模拟物和基于唾液酸酶的方法影响TME中多种细胞类型（包括肿瘤细胞和免疫细胞）的唾液酸聚糖，并与改善的肿瘤控制相关（图3）。在机制上，去唾液酸化改善DCs和肿瘤细胞上MHC-I的稳定性，增强DC成熟及其T细胞致敏能力，并促进效应T细胞功能。此外，观察到的治疗获益可能反映不仅反式而且顺式Siglec相互作用的破坏。因此，确定免疫细胞上顺式配体的贡献仍是未来研究的重要目标。图3展示肿瘤去唾液酸化支持更免疫允许的TME：与健康组织（左图）相比，TME的特征是抑制性Siglec受体和唾液酸聚糖表达增加；这些变化共同通过反式相互作用以及可能的顺式相互作用增强抑制性Siglec信号，从而促进TME中的免疫抑制（中图）；肿瘤局部去唾液酸化破坏肿瘤和基质细胞上的反式配体，并可能同时去除肿瘤浸润免疫细胞上的顺式配体；连同去唾液酸化的Siglec非依赖效应，这些作用可能促进更免疫允许的TME并增强抗肿瘤免疫应答（右图）。

关于人类肿瘤，仅有少数研究探讨了免疫细胞上顺式配体的潜在表达。两项研究报道了胶质瘤和肺癌患者髓源性抑制细胞（MDSCs）上Siglec和唾液酸聚糖的共同表达。值得注意的是，肺癌患者外周血来源的MDSCs上Siglec-9、Siglec-10和唾液酸聚糖的表达丰度高于健康供者的相应髓系细胞。尽管这些发现表明Siglec受体及其配体在同一细胞上共表达，但并未直接证明功能性顺式结合。此外，已报道人免疫抑制性细胞类型（如调节性T细胞和抗炎巨噬细胞，常存在于免疫抑制性TME中）上α2-6唾液酸化增加。理论上，免疫细胞上抑制性Siglec及其顺式配体表达升高可能通过促进Siglec顺式配体相互作用而促进免疫抑制。TME高度唾液酸化的性质引出了抑制性Siglec信号在多大程度上由顺式还是反式配体驱动的问题。肿瘤和基质细胞常高表达唾液酸聚糖（包括Siglec配体），尽管存在顺式配体，仍可能以反式方式结合Siglec。此外，免疫细胞活化和分化伴随唾液酸聚糖表达的动态变化，且多种Siglec受体在TME中上调。这些变化共同可能使反式与顺式配体之间的平衡向TME中肿瘤和/或基质细胞对Siglec的反式结合增加的方向偏移。确定顺式和反式配体如何共同塑造人肿瘤中Siglec功能，对于合理设计靶向Siglec-唾液酸聚糖轴的疗法具有重要意义。此类见解可能有助于阐明干预应主要靶向肿瘤和基质细胞上的反式配体、免疫细胞上的顺式配体，还是二者联合。

结论与展望

Siglec-唾液酸聚糖轴已成为癌症免疫治疗的一个有前景的靶点，然而免疫细胞上唾液酸顺式配体在调节Siglec功能中的作用仍基本未被探索。顺式配体可能不仅作为Siglec受体的结合伴侣，还通过控制Siglec用于反式结合的可及性、基础性抑制信号以及细胞膜上的受体组织来主动调节免疫细胞活性。一个关键的未决问题是，TME中顺式和反式配体对Siglec受体结合的这些变化在多大程度上转化为下游信号和功能性免疫应答的改变。本综述还强调了免疫细胞唾液酸化在分化和活化过程中的动态性质。然而，对于大多数Siglec家族成员而言，内源性Siglec特异性顺式配体的身份以及这些过程对其组成和功能的影响仍基本未被阐明。因此，确定免疫细胞活化和肿瘤浸润如何塑造Siglec顺式配体组成，以及这些变化如何影响受体可及性和信号传导，是未来研究的重要课题。体内研究证据表明去唾液酸化增强抗肿瘤免疫。重要的是，唾液酸模拟物和基于唾液酸酶的治疗策略同时影响肿瘤细胞和免疫细胞；因此，所产生的治疗获益可能源于反式和顺式Siglec相互作用的破坏以及Siglec非依赖效应。剖析这些机制的相对贡献需要开发能够选择性操控Siglec顺式配体的实验方法。同时，确定调控顺式与反式Siglec结合平衡的因素对于理解Siglec在癌症生物学中的作用至关重要。总之，免疫细胞上顺式配体对Siglec的调节，无论在一般层面还是在肿瘤免疫背景下，都是一个关键但研究不足的领域。揭示这一复杂性对于推进癌症和自身免疫性疾病中靶向Siglec的免疫治疗至关重要。