《Micromachines》：Glioma-on-a-Chip: Microengineering Platforms for Unraveling Tumor-Induced Epileptogenesis and Personalized Neuro-Oncology
编辑推荐：
先天性畸形、医源性损伤及输尿管获得性疾病常导致结构或功能缺损，然而用于输尿管修复与重建的组织工程方法仍然有限。本研究通过酶消化和甲基丙烯酸酐修饰，由猪膀胱脱细胞基质（BAM）合成了可光交联的膀胱脱细胞基质（BAMMA）。研究人员全面表征了GelMA、GelMA
先天性畸形、医源性损伤及输尿管获得性疾病常导致结构或功能缺损，然而用于输尿管修复与重建的组织工程方法仍然有限。本研究通过酶消化和甲基丙烯酸酐修饰，由猪膀胱脱细胞基质（BAM）合成了可光交联的膀胱脱细胞基质（BAMMA）。研究人员全面表征了GelMA、GelMA/BAMMA和BAMMA水凝胶的力学与生物学特性，并以GelMA/BAMMA水凝胶与脂肪源性间充质干细胞（ADSCs）混合物作为生物墨水，制备了3D生物打印管状支架，随后将其包埋于大鼠大网膜中。GelMA/BAMMA复合水凝胶结合了GelMA良好的力学性能与BAMMA的生物活性，支持ADSCs的生长与增殖。大网膜包埋一周后，组织学与免疫组织化学分析显示，与未接种细胞的对照相比，接种ADSCs的支架内组织重塑增强、新生血管形成增加且局部炎症反应减轻。这些结果表明，负载ADSCs的GelMA/BAMMA生物打印管状支架可在大鼠大网膜模型中进行组织重塑与血管化，为输尿管组织工程提供了一种可行的水凝胶生物墨水，并为未来输尿管修复研究奠定了基础。
输尿管先天性畸形及医源性损伤、肿瘤、炎症、创伤和感染等获得性疾病均可导致输尿管结构或功能缺损，其中长段（>5 cm）输尿管狭窄及上、中段输尿管缺损的处理仍是泌尿外科医师面临的复杂临床难题。目前长段输尿管缺损的手术重建常采用回肠、阑尾、颊黏膜、舌黏膜、膀胱肌瓣和血管等自体组织或器官，但术后常伴随黏液分泌、结石形成、再狭窄、尿路感染和肾功能损害等并发症，因此亟需开发既能恢复输尿管解剖结构与生理功能、又能降低并发症发生率的新型替代方案。近年来，基于种子细胞与支架材料的组织工程输尿管成为长段输尿管缺损修复重建的有前景的治疗途径。脂肪源性间充质干细胞（ADSCs）因来源广泛、易于获取且具备优良的分化与旁分泌能力，成为输尿管组织工程中最常用的种子细胞。支架材料方面，天然生物材料因良好的生物降解性和模拟细胞外基质（ECM）的生物相容性而备受青睐，其中脱细胞基质材料去除了可引发免疫反应的细胞成分而保留了原始组织或器官的ECM结构与组成，膀胱与输尿管同源于泌尿生殖窦且组织构成相似（均具有尿路上皮衬里和平滑肌层），膀胱ECM含有与尿路再生相关的生长因子和细胞因子等组织特异性生物活性因子，故被选为组织特异性ECM来源。明胶缺乏稳定三螺旋结构导致力学性能差和降解不可控，经甲基丙烯酰基修饰的GelMA通过交联形成兼具生物相容性与可调控力学性能的水凝胶，但GelMA缺乏组织特异性生物学线索，对尿路谱系细胞分化的导向能力有限，将其与组织特异性ECM组分复合是提升其生物学性能的策略。在体外构建方面，三维（3D）生物打印通过逐层打印可精确控制生物材料、生化因子和活细胞在不同层内的空间排布，从而复制靶器官的正常生理结构，已成为器官组织工程的研究热点。基于此，研究人员制备猪BAM并经甲基丙烯酸酐（MA）修饰获得可光交联的BAMMA，在体外全面表征GelMA、BAMMA和GelMA/BAMMA水凝胶的力学与生物学性能并选择GelMA/BAMMA水凝胶作为生物墨水基质，以GelMA/BAMMA水凝胶与ADSCs混合物作为生物墨水，通过3D生物打印制备负载ADSCs的输尿管组织工程管状支架，随后将生物打印管状支架包埋于大鼠大网膜中，观察支架内组织重塑及周围组织新生血管形成。研究得出，合成的BAMMA水凝胶不仅具有快速凝胶特性，还具备良好的生物降解性和促进ADSCs增殖的能力，表明BAMMA合成体系的稳定性；GelMA/BAMMA复合水凝胶结合了GelMA良好的力学性能与BAMMA优异的生物学性能，为输尿管组织工程的3D生物打印提供了高性能水凝胶；以GelMA/BAMMA水凝胶与ADSCs混合物为生物墨水成功打印管状支架且ADSCs在构建体内分布均匀；3D生物打印管状支架经大网膜包埋后可观察到支架内组织重塑及周围新生血管网络形成。该研究为输尿管组织工程提供了一种可行的水凝胶生物墨水，并为未来输尿管修复研究奠定了基础。
研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：以猪膀胱组织经Triton X-100和十二烷基硫酸钠（SDS）脱细胞制备BAM，经胃蛋白酶消化和甲基丙烯酸酐修饰合成BAMMA，并以1H NMR和2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）法测定甲基丙烯酰化程度；制备GelMA、GelMA/BAMMA和BAMMA水凝胶并以0.25%（w/v）LAP为光引发剂经405 nm紫外光交联；通过扫描电子显微镜（SEM）、流变学分析、溶胀率、降解率、压缩与拉伸测试及细胞毒性（活/死染色与CCK-8）评价水凝胶；以GelMA/BAMMA与ADSCs（1×10
7 cells/mL）为生物墨水经挤出式3D生物打印机打印网格与管状支架；将管状支架缝合于8周龄SD大鼠大网膜，一周后取材行H&E、Masson、DAPI及CD31、TNF-α、IL-10免疫组织化学分析。
研究结果如下：3.1 BAMMA的合成——通过H&E、Masson和DAPI染色及DNA定量证实BAM成功脱细胞且胶原结构保留，残余DNA含量显著低于天然膀胱组织；1H NMR出现5.25 ppm和5.53 ppm两个新峰，TNBS法测得BAMMA甲基丙烯酰化率为57.63 ± 9.84%，含0.25%（v/v）LAP的BAMMA溶液经405 nm紫外光照射1 min即可成胶。3.2 水凝胶表征——SEM显示GelMA孔隙结构较BAMMA更丰富、GelMA/BAMMA呈中间形态，GelMA与GelMA/BAMMA孔径无显著差异且均显著大于BAMMA，GelMA孔隙率最高、GelMA/BAMMA次之、BAMMA最低；温度扫描显示三组水凝胶均具可逆溶胶-凝胶转变，均表现出良好的剪切变稀行为且GelMA/BAMMA黏度居中；三组均在48 h达溶胀平衡，GelMA与GelMA/BAMMA溶胀率无显著差异且均显著高于BAMMA；降解率随时间近线性增加，24 h时BAMMA几乎完全降解、显著高于GelMA/BAMMA和GelMA，GelMA降解最慢；GelMA压缩性能显著优于GelMA/BAMMA和BAMMA，GelMA/BAMMA压缩模量高于BAMMA；GelMA拉伸性能显著优于其余两组，GelMA/BAMMA杨氏模量高于BAMMA。3.3 生物相容性——活/死染色显示ADSCs在三组水凝胶浸提液中均可存活且无明显死亡；CCK-8显示第1天各组OD值无显著差异，第3天GelMA/BAMMA组OD值高于GelMA组，第5天GelMA/BAMMA组显著高于GelMA组但显著低于BAMMA组。3.4 3D生物打印——GelMA/BAMMA溶液经打印机挤出形成连续细丝，成功打印网格支架，可打印性因子（Pr）为1.05 ± 0.04，接近1表明打印宏孔接近设计方形几何、形状保真度良好；以每10层405 nm紫外光照射15 s的交联策略成功制备直径1 cm、长3 cm的管状支架，共聚焦显微镜观察显示标记ADSCs在网格支架和管状支架内均匀分布。3.5 组织学检查——大网膜包埋一周后H&E染色显示生物打印管状支架被周围组织完全包裹、层次结构清晰（中心为输尿管腔UL、中层为水凝胶基质HM、最外层为包裹的周围组织ST），Masson染色显示植入部位胶原沉积，实验组胶原纤维较粗且排列相对疏松、对照组较细且致密，水凝胶基质层内可见细胞浸润与组织重塑、最外层周围组织可见血管样结构；实验组支架内组织重塑面积显著大于对照组，细胞迁移距离百分比亦显著优于对照组。3.6 免疫组织化学分析——DAPI染色显示对照组水凝胶基质上仅少量细胞分布，实验组可见大量细胞及绿色荧光标记的ADSCs；CD31免疫组化显示两组支架周围组织均可见血管样结构，实验组支架周围组织血管数量及CD31阳性面积均显著大于对照组；TNF-α与IL-10免疫组化显示负载ADSCs的GelMA/BAMMA支架组促炎标志物TNF-α表达相对较低而对照组TNF-α免疫反应较强，抗炎细胞因子IL-10在负载ADSCs组植入物周围分布更丰富。
讨论部分总结：水凝胶因力学强度、生物相容性、生物降解性及与体内ECM相似而广受关注，但用于输尿管组织工程的报道较少。本研究选择BAMMA与GelMA两种水凝胶混合物作为管状支架材料，优先选用BAM是因膀胱与输尿管组织学同源、具有尿路上皮、固有层和平滑肌的可比分层结构，且保留较异源组织（如小肠黏膜下层或真皮）更适合输尿管再生的尿路特异性生物活性线索；BAM经胃蛋白酶消化产生暴露氨基的肽片段，再经甲基丙烯酸酐修饰形成酰胺键而合成具快速光交联性能的BAMMA。所用商品化GelMA甲基丙烯酰化度为60 ± 5%，因BAMMA由无均匀重复序列的异质肽片段组成而无法由1H NMR准确计算其甲基丙烯酰化度，故采用定量游离伯氨基减少的TNBS法评估，三批独立BAMMA平均甲基丙烯酰化度约57.63%，考虑到ECM源性材料的批间差异，每批BAMMA均常规检测且仅甲基丙烯酰化度在50%–70%之间的批次用于下游实验以稳定理化与生物学性能。组织学染色、DNA定量、1H NMR和TNBS证实在BAM成功脱细胞与甲基丙烯酰化；BAMMA具良好细胞相容性和促进ADSC增殖能力，可归因于胃蛋白酶消化和甲基丙烯酰化过程中保留的血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子-BB和角化细胞生长因子等生物活性ECM组分，这种生物活性是ECM源性水凝胶相对合成材料的关键优势；BAMMA的快速生物降解性有利于需快速组织整合的应用，但不利于长期结构支撑，且纯BAMMA水凝胶储能模量低、抗压弱、延展性差，难以在挤出过程中保持形状保真且易在生理载荷下碎裂，这与ECM源性水凝胶通常优先生物功能性而牺牲力学强度的固有特性一致；GelMA则提供互补的力学增强，包括更高储能模量、改善的可打印性和增强的结构稳定性，同时保持细胞相容性。将提供组织特异性生物活性与生长因子保留的BAMMA与提供力学支撑和可打印性的GelMA复合，旨在构建同时满足3D生物打印管状支架生物学与力学需求的协同生物墨水体系，该复合策略发挥各组分优势并弥补其各自局限，是合理的生物打印材料设计思路。将GelMA引入BAMMA体系基于研究人员既往3D生物打印经验和GelMA力学性能，共混策略旨在解决BAMMA特定的力学缺陷同时保留其优良生物学特性；GelMA/BAMMA复合物的互连孔网络具功能意义，为氧气、二氧化碳和营养物质交换提供必要通道，这是厚构建体内细胞存活和组织整合的前提；GelMA/BAMMA组平均孔径小于纯GelMA组，是因BAMMA由脱细胞膀胱基质的异质刚性ECM片段组成、具有包括氢键和静电吸引在内的丰富物理链间相互作用，这些相互作用在共价光交联前诱导BAMMA域早期预聚集，调节液-液相分离动力学并限制凝胶化和冷冻干燥过程中富水成孔域的尺寸，尽管孔径减小，复合水凝胶仍保持有利于细胞迁移和营养扩散的互连孔隙；然而早期微聚集仅形成孤立离散域而非长程连续网络，完全光固化后纯BAMMA无法在这些分离聚集体间建立渗透性共价骨架，导致富含结构缺陷的疏松不连续交联结构，进而解释其快速降解和较差力学性能；引入GelMA后储能模量和力学强度大幅提高，满足挤出式生物打印的可打印性和结构稳定性要求；从生物学角度，GelMA/BAMMA复合物较纯BAMMA降解更慢是刻意设计考量，理想情况下支架生物降解速率需与新组织形成速率匹配，复合水凝胶延长的降解曲线为组织再生提供更长的时间窗口同时维持结构支撑，这对输尿管组织工程尤为重要，因支架须在初始愈合阶段维持管腔通畅，但需注意GelMA/BAMMA水凝胶的实际体内降解曲线可能与体外酶降解结果差异较大，因体内降解受酶活性、力学载荷、细胞重塑和免疫介导降解等多因素影响，此体内降解行为尚待未来植入研究验证；复合物保持的生物相容性及维持支持ADSC增殖的能力证实共混策略成功保留了BAMMA的生物学优势同时获得必要力学性能，GelMA/BAMMA复合水凝胶是一种合理设计的生物墨水，在生物功能性与力学可打印性之间取得平衡，适用于输尿管组织工程管状支架的3D生物打印。当前3D打印是组织工程中应用最广泛的技术之一，通过逐层打印可精确控制生物材料、生化因子和活细胞在不同层内的空间定位从而模拟靶器官正常生理结构，是当前组织工程器官重建的研究热点并已初步应用于皮肤、血管系统和软骨等多种组织器官；3D生物打印技术为仿生构建具有输尿管壁多层结构的工程化输尿管提供了新途径，本研究采用挤出式3D生物打印机打印管状支架，挤出式3D生物打印的打印保真度高度依赖水凝胶生物墨水的流变学特性，GelMA/BAMMA水凝胶的剪切变稀和热敏特性是其可打印性的关键决定因素：剪切变稀降低喷嘴内剪切应力下材料黏度，利于顺畅挤出并最小化对包封细胞的损伤，剪切应力去除后黏度快速恢复，有效维持打印构建体形态并防止结构坍塌和铺展；热敏特性实现温度诱导的溶胶-凝胶相转变，使水凝胶在打印时保持良好流动性并在沉积后冷却时快速固化，从而最大化3D打印构建体的结构稳定性；共聚焦显微镜证实ADSCs在管状支架内均匀分布，进一步表明生物打印过程不损害细胞活力或空间分布，这对在整个管状支架内实现均匀组织再生至关重要；打印管状支架时研究人员曾尝试制备长段（>5 cm）构建体，当打印高度超过3 cm时整个管状支架开始晃动甚至倾斜，可能原因是缺乏内部支撑使中空管状支架随打印高度增加而不稳定，尽管存在长度限制，3D生物打印因对多层结构的精确空间控制和均匀细胞分布仍是输尿管组织工程的有前景方法，长度限制未来可通过优化打印参数、生物墨水配方和打印策略克服，研究人员正尝试采用悬浮打印解决该问题。组织工程支架植入体内后其生存环境由体外培养基环境转变为体内间质液环境，需快速建立血液循环为种子细胞提供营养和氧气以使其存活并发挥后续功能，因此快速血管化是组织工程修复重建的关键步骤，直接决定再生结局的成功；本研究中接种ADSCs的管状支架较未接种者组织重塑和血管化显著增强，可归因于多种协同机制：GelMA/BAMMA水凝胶内残余生物活性因子促血管生成，ADSCs可通过分化为内皮细胞和周细胞样细胞直接参与新生血管形成，也可通过分泌促血管生成生长因子和细胞外囊泡间接促进新生血管形成，因此ADSCs可能通过多种途径促进生物打印管状支架周围组织血管生成；除水凝胶固有生物活性和ADSCs旁分泌与分化效应外，大网膜作为高度血管化组织通过丰富的生长因子、细胞因子和祖细胞供应为新生血管形成提供有利微环境，研究人员既往研究证实将组织工程支架包埋于大网膜可增强血管反应，但本研究中仅在生物打印支架周围宿主组织检测到强烈血管生成，未观察到水凝胶基质内明显的血管长入，此现象可能归因于大网膜包埋时间有限或缺乏引导支架基质内有序血管再生的预定义通道；总之，组织特异性GelMA/BAMMA水凝胶、ADSC递送和大网膜包埋发挥联合促血管生成效应，支持支架周围组织血管结构形成。尽管BAMMA来源于异种猪膀胱脱细胞基质，植入后未检测到明显免疫排斥和严重异物反应，此良好免疫特性主要归因于脱细胞过程大幅去除细胞抗原并极大减轻原始ECM组织的固有免疫原性，且水凝胶内包封的ADSCs进一步调节局部炎症微环境，与TNF-α和IL-10免疫组化显示负载ADSCs组较无细胞对照炎症反应更轻的结果一致，支持ADSCs的免疫调节能力；实验组观察到细胞和组织向植入水凝胶支架内迁移，但所检测时间点水凝胶基质内未形成成熟血管通道；Masson染色进一步显示负载ADSCs构建体周围环绕较厚且排列疏松的胶原纤维；总之，这些发现表明负载ADSCs的GelMA/BAMMA水凝胶支架在大网膜包埋后保留促进组织重塑的能力；值得注意的是，大网膜包埋对输尿管重建设计具额外战略意义，此大网膜包埋作为后续输尿管重建的预血管化准备步骤，得益于大网膜良好的活动性，大网膜包裹的构建体将无需将支架与大网膜分离而直接用于输尿管替代，这种分期包埋与移植方法具临床可行性，保留的大网膜作为血管蒂在转移至输尿管缺损后维持移植物灌注。本研究虽成功以3D生物打印机和GelMA/BAMMA水凝胶打印管状支架，但打印支架长度仅3 cm，未能实现长段（>5 cm）管状支架；此外虽对GelMA/BAMMA水凝胶进行了体外生物降解实验，但支架降解与组织再生之间的动态平衡是评价水凝胶材料的关键指标，本研究未开展管状支架的体内生物降解研究；本研究仅完成管状支架的3D生物打印和大网膜包埋，未进行输尿管损伤后的原位修复重建实验；未来研究将聚焦解决上述问题，旨在实现管状支架长段3D生物打印、开展管状支架体内生物降解研究、进一步改进3D生物打印所需生物墨水材料，并完成生物打印管状支架修复重建输尿管缺损的体内实验，从而全面评价生物打印管状支架修复重建输尿管缺损的疗效。
研究结论部分翻译：本研究合成的BAMMA水凝胶不仅表现出快速凝胶特性，还具备良好的生物降解性和促进ADSCs增殖的能力，证明了BAMMA合成体系的稳定性。此外，由GelMA与BAMMA充分混合制备的GelMA/BAMMA复合水凝胶结合了GelMA良好的力学性能与BAMMA优异的生物学性能，为输尿管组织工程的3D生物打印提供了高性能水凝胶。以GelMA/BAMMA水凝胶与ADSCs混合物作为生物墨水，通过3D生物打印机成功打印了管状支架，并观察到ADSCs在构建体内均匀分布。随后将3D生物打印管状支架包埋于大网膜，可观察到支架内组织重塑及周围新生血管网络形成。
