微阵列数据中细胞类型反卷积技术的基准测试

《iScience》：Benchmarking of cell type deconvolution techniques for microarray data

• 十种解卷积算法在多种分析条件下进行了基准测试
• MuSiC、qprogwc和CIBERSORTx表现出更优的解卷积准确性
• 稀有细胞类型更难恢复，但顶级方法仍然最准确
• qprogwc兼具高准确性和计算效率

摘要

细胞类型解卷积算法近年来取得了显著进展。然而，这些算法应用于微阵列数据时的性能仍存在明显空白，而微阵列数据在众多疾病背景下广泛可用。在此，我们比较了现有细胞类型解卷积算法在微阵列批量转录组背景下，跨多种数据准备场景和不同细胞类型的性能。在评估的十种算法中，MuSiC、qprogwc和CIBERSORTx脱颖而出，展现出估计值与真实细胞类型组成之间的最高相关性（rmax分别为0.74、0.69和0.67）。我们的研究为微阵列解卷积提供了一个实用框架，同时强调了提高这些技术精度的必要性。此类方法将释放公共领域大量微阵列数据仓库的全部潜力，促进对多种疾病状态下细胞组成的深入理解，并推动转化研究。

图文摘要

引言

细胞作为生命的基本单位，以复杂的模式组织形成组织和器官，每种组织器官都有独特的基因表达谱和形态。传统的批量基因表达分析方法虽然有助于获取总体平均数据，但往往掩盖了单个细胞的细微特性。这一局限推动了单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的发展，该技术显著加深了我们对细胞异质性的理解。然而，该技术较高的成本限制了其在不同疾病条件和大量样本中的应用。另一方面，在不同疾病条件和大量样本中，存在海量的基于微阵列的批量基因表达数据，仍可用于基础研究和转化研究。

细胞类型解卷积技术旨在估计批量数据中混合群体内的细胞类型组成，从而使研究人员能够剖析单个细胞类型对组织整体基因表达谱的贡献。这在细胞组成可显著影响疾病进展和治疗反应的研究中尤为重要。因此，细胞类型解卷积对于深化我们对生物过程和疾病机制的理解至关重要。

当前的细胞类型解卷积方法利用计算算法从批量数据中推断细胞类型比例。已有基准研究评估了它们在不同条件下的性能，如数据准备方法、不同噪声水平、细胞类型异质性以及稀有细胞类型的存在。机器学习技术（如集成学习和深度学习）的整合也已被探索，以提高解卷积方法的准确性和稳健性。这些方法有望捕捉传统算法可能遗漏的数据中的复杂模式。

然而，一个重要的知识缺口仍有待填补。最近的方法和基准研究大多关注批量RNA-seq数据集，并有机会使用单细胞RNA-seq数据作为细胞类型估计的参考。然而，大多数为微阵列数据开发的解卷积方法依赖于有限的预定义特征矩阵。特征矩阵是一个参考文件，为每种细胞类型分配特定基因及其权重，从而能够区分组织内的细胞亚群并估计批量转录组中的细胞类型比例。不幸的是，用于微阵列解卷积的特征矩阵通常来源于荧光激活细胞分选（FACS）分离的数据集，这些数据集通常仅适用于血液，限制了其更广泛的应用。尽管单细胞转录组资源允许构建更广泛的特征，但平台差异意味着这些特征在整合到微阵列解卷积之前需要额外的校准和验证。另一方面，微阵列数据集的生成仍然更具成本效益，更重要的是，它们是最广泛可用的数据之一。一个典型的例子是基因表达综合数据库（GEO）。该数据库目前包含约700万个不同物种样本的组学数据，其中约400万个为人类样本。在人类基因表达谱中，41%的提交数据集仍为阵列类型，代表了许多不同疾病状况的样本。这是一个强有力的论据，支持利用这类数据来回答健康和疾病以及微环境中细胞组成的问题，并促进我们对潜在生物学过程和疾病机制的理解。

在此，我们使用相同的微阵列批量数据集作为输入，以及相同的scRNA-seq参考面板用于模型训练，对10种最新的细胞类型解卷积技术进行了基准比较。重要的是，批量数据集来源于FACS分离的样本，因此每个样本的真实细胞类型组成是已知的。这使我们能够定量比较不同方法的性能。我们对批量数据和参考数据集的各种数据准备流程进行了比较，测试了在多探针基因中选择探针以匹配参考的不同策略，并评估了基于微阵列的细胞类型解卷积的最佳条件组合。总体研究设计如图1所示，简化示意图见图S1。研究的主要组成部分见图S2。

图1 总体研究设计示意图

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PBMC：来自10× Genomics网站的2,700个外周血单核细胞，用作单细胞RNA测序参考面板。微阵列数据集用作批量转录组输入。该数据集包含114个样本，其细胞类型组成通过FACS技术已知。QN：分位数归一化，RMSE：均方根误差。

结果

比较线性和对数转换的scRNA-seq参考数据集，确认了两个版本均质量良好且有效，依据以下标准：a）细胞类型相似性矩阵：在两个数据集版本中，相似血细胞类型的表达测量值几乎相互关联（例如，记忆和初始CD4 T细胞在两个版本中均显示r > 0.6，FCGR3A+和CD14+单核细胞在两个版本中均显示r > 0.5），以及b）层次聚类：应用层次聚类算法后，相关细胞类型聚集在一起，其中对数转换版本更有意义，将CD14+和FCGR3A+两个单核细胞组聚为一个簇（图2A –底部部分）。

图2 数据准备可视化，显示批量微阵列以及scRNA-seq参考数据集的有效性

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(A) 外周血单核细胞（PBMC）参考中细胞类型表达谱的成对相关性和层次聚类，以原始线性和对数转换尺度显示。
(B) 分位数归一化（QN）之前（左）和之后（右）的批量微阵列数据。B：B淋巴细胞，NK：自然杀伤细胞，DC：树突状细胞，Mono：单核细胞。

微阵列数据的分位数归一化生成了样本间均匀且可比的基因表达数据分布（图2B）。在将微阵列样本的细胞类型与scRNA-seq参考的细胞类型匹配的过程中，发现了一个不一致之处：微阵列样本中仅有一个单核细胞组，而scRNA-seq参考中存在两个独立的单核细胞类型，即CD14+和FCGR3A+单核细胞。为了匹配批量数据和参考数据集中的这些细胞类型，我们根据CD14和FCGR3A基因表达水平的分布，将微阵列单核细胞类型样本分为两组。考虑CD14原始表达值超过13000的经验阈值将单核细胞分配到CD14+亚型（图S3）。

在数据准备条件中，使用所有探针和QN微阵列数据总体更好（表1和表2），而将数据缩减为仅单探针基因则降低了所有方法的性能（图3A）。对于scRNA-seq参考，使用对数转换数据总体产生最佳性能（表3）。

图3 不同数据准备条件和不同细胞类型下不同算法的预测性能比较

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(A) 不同数据准备条件下不同算法的真实与估计细胞类型比例之间的相关系数（Pearson's r）和B）均方根误差（RMSE）。数据准备条件包括：1–5）线性scRNA-seq数据作为参考和五个版本的微阵列数据（即原始数据使用所有探针、仅使用单探针基因、使用多探针基因但随机选择探针以匹配参考基因、使用多探针基因但基于与scRNA-seq参考的最佳基因表达相关性选择探针、以及所有探针的分位数归一化（QN）数据）作为输入批量数据集，以及6）对数归一化scRNA-seq数据作为参考和所有探针的原始微阵列数据作为输入批量数据集。误差线表示使用bootstrap方法计算的95%置信区间（CI95%）。
(C) 不同算法在不同细胞类型下的预测性能。未显示负相关值。
(D) 预测性能与scRNA-seq参考面板中细胞类型覆盖度的相关性。

标准 | 所有探针 | 最佳探针选择 | 随机探针选择 | 仅单探针基因
---|---|---|---|---
相关系数 r | 6 | 3 | 1 | 0
RMSEa | 4 | 2 | 3 | 1

表1 每种探针选择策略在其他探针选择策略中获得最大性能的细胞类型解卷积算法数量
RMSE：均方根误差。
a最大性能意味着最高的r但最低的RMSE。
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标准 | 分位数归一化前的微阵列数据 | 分位数归一化的微阵列数据
---|---|---
相关系数 r | 1 | 9
RMSEa | 3 | 7

表2 每种微阵列数据准备策略在其他微阵列数据准备策略中获得最大性能的细胞类型解卷积算法数量
RMSE：均方根误差。
a最大性能意味着最高的r但最低的RMSE。
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标准 | 对数归一化前的scRNA-seq数据 | 对数归一化的scRNA-seq数据
---|---|---
相关系数 r | 1 | 9
RMSEa | 5 | 5

表3 每种单细胞RNA-seq参考数据准备策略在其他参考数据准备策略中获得最大性能的细胞类型解卷积算法数量
RMSE：均方根误差。
a最大性能意味着最高的r但最低的RMSE。
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对不同细胞类型解卷积算法在估计批量微阵列样本中细胞类型比例的性能进行比较，显示CIBERSORTx、dtangle、MuSiC、qprogwc和svr在不同条件下具有最高的Pearson相关系数（r > 0.5）（图3A）。其中，CIBERSORTx、MuSiC和qprogwc还显示出最低的均方根误差（RMSE），即<0.3（图3B；图S4）。方法间的统计分析也支持这一结论（表S1、S2和S3）。模拟的伪批量样本也显示CIBERSORTx、MuSiC和qprogwc的最佳性能（图S5）。

对于不同细胞类型，细胞类型解卷积的性能显示出很大差异，qprogwc和MuSiC的中位相关系数（r）最高，qprogwc和CIBERSORTx的平均相关系数最高（图3C；表4）。参考中细胞类型的覆盖度对预测性能有一定影响；然而，这未得到统计学证实（所有相关p值均不显著，即>0.05）（图3D）。另一方面，将混合样本按细胞类型丰度分组显示，大多数算法在估计稀有细胞群体时准确性较低，而更普遍的群体则相对较好（图S6）。在评估的方法中，CIBERSORTx、MuSiC和qprogwc整体表现出最低的估计误差。

方法 | 平均性能 | 中位性能 | # 最大性能a | 最大性能
---|---|---|---|---
qprogwc | 0.69 | 0.81 | 2 | 0.87
MuSiC | 0.58 | 0.66 | 2 | 0.92
CIBERSORTx | 0.64 | 0.63 | 2 | 0.95
dtangle | 0.63 | 0.63 | 2 | 0.94
nnls | 0.57 | 0.64 | 0 | 0.88
svr | 0.57 | 0.61 | 0 | 0.93
rls | 0.54 | 0.55 | 0 | 0.93
Scaden | 0.56 | 0.45 | 0 | 0.92
ols | 0.43 | 0.44 | 0 | 0.88
qprog | 0.43 | 0.44 | 0 | 0.88

表4 基于估计值与真实细胞类型比例的相关系数，对不同细胞类型解卷积算法进行的比较
表格按1）#最大性能和2）中位性能排序。
a方法获得最大性能的细胞类型数量。
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在微阵列和scRNA-seq参考数据的最佳预处理设置组合下，对三种优先方法（即MuSiC、qprogwc和CIBERSORTx）的最终比较显示，MuSiC与真实细胞类型比例的整体相关性最高（Pearson's r = 0.74）（图4）。

图4 前三名表现者的预测性能比较

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使用原始微阵列数据集或QN归一化微阵列数据集，结合对数转换的scRNA-seq参考面板，比较qprogwc（A和B）、MuSiC（C和D）和CIBERSORTx（E和F）。左侧三部分面板为估计（左侧两部分）与真实（右侧部分）细胞类型比例，右侧两部分面板为每个样本这两个值之间的绝对差。

更改单细胞参考时的性能比较也支持上述三个最佳表现者，同时显示dtangle、Scaden和svr的可接受性能（图S7）。然而，在考虑运行时间和内存使用时，CIBERSORTx、svr、MuSiC 和 Scaden 等方法相对于其他耗时和内存需求较少的方法而言，计算效率较低（图 S8）。

讨论

我们对不同最先进的细胞类型反卷积算法在微阵列技术生成的批量数据集上的预测性能进行了比较研究。我们基于批量微阵列数据集以及单细胞 RNA 测序参考的不同数据准备技术，以及不同的细胞类型进行了比较。

在评估的方法中，MuSiC、qprogwc 和 CIBERSORTx 表现出优越的性能，产生了最高的相关系数（r > 0.5）和最低的均方根误差（RMSE < 0.3）。总体预测准确率最佳的是 MuSiC 流程（r = 0.74；RMSE = 0.21），该流程应用于经过 QN 归一化的微阵列数据，并使用对数转换的 scRNAseq 参考面板。

我们还表明，预测性能在不同细胞类型之间存在显著差异（图 3C），相关系数范围从 ?0.07（初始 CD4 T 细胞）到 0.95（B 细胞），并且这种变异性在统计学上未被证实与参考中相应细胞类型的丰度相关（所有相关性 p 值 > 0.05）（图 3D）。总体而言，三种表现最佳的方法（MuSiC、qprogwc 和 CIBERSORTx）在不同细胞类型中产生了高相关性（中位数 r ≈ 0.7）。

我们研究的优势包括：i）首次聚焦于微阵列批量数据中的细胞类型反卷积；ii）通过设计不同的探针-基因匹配场景来评估多探针基因对预测性能的影响；iii）评估不同细胞类型之间的性能；以及 iv）展示从较经典算法到基于机器学习和人工智能的算法等广泛反卷积技术的性能。

在我们的模拟中，我们生成了混合微阵列数据。需要认识到这些模拟是对真实世界场景的近似。微阵列数据基于强度读数而非计数读数，这意味着其底层分布并非严格线性。因此，在极低或极高强度水平下可能会出现偏离线性的情况。

尽管我们的分析侧重于比较输入数据集在常用预处理步骤下的反卷积性能，但我们承认其他归一化、转换或标记基因选择策略可能会影响预测性能。对本文推荐的顶级方法的最佳预处理选择进行系统评估需要专门的前瞻性研究，这超出了本工作的范围。

另一个考虑因素是，几乎所有方法在不同细胞类型上的预测性能都存在较大差异，这不能归因于 scRNAseq 参考中覆盖深度的变化，提示其他生物学或技术因素在起作用。一个具体的例子是初始 CD4 T 细胞的性能低于其他细胞类型。这种性能降低的潜在原因可能包括用于初始 CD4 T 细胞的参考谱的质量或代表性存在局限，可能无法完全捕捉其独特的基因表达模式，或者初始 CD4 T 细胞本身的固有特征，例如标记基因表达不够显著，这对当前的反卷积算法构成了挑战。这一观察也凸显了反卷积工具在尝试解析密切相关或谱系相近细胞类型时面临的更广泛挑战。除了标记基因特异性和参考数据的质量外，准确区分此类群体的能力还依赖于算法模型的潜在假设。显然需要进一步研究以探索细胞类型异质性和相似性对预测性能的影响。在受控的细胞类型相似性梯度上研究性能需要专门设计的数据集，这构成一个重要的、但独立的方法学问题，超出了本研究的范围。

需要更多研究来探索细胞类型多样性对预测性能的影响。这也可能与反卷积工具解析密切相关或谱系相近细胞类型的能力相互作用。区分此类群体通常取决于标记基因特异性、参考质量和算法建模假设。在受控的细胞类型相似性梯度上研究性能需要专门设计的数据集，这构成一个重要的但独立的方法学问题。

同样，微阵列和 RNA-seq 平台之间的固有差异——包括动态范围、背景噪声、探针杂交行为和检测灵敏度——可能导致不同工具之间的性能差异。剖析这些平台特异性因素的个体效应需要有针对性的实验或计算设计。我们强调这些方面是未来方法学研究的重要方向，但不属于本研究的主要目标，本研究的主要目标是表征已建立的反卷积工具在真实微阵列数据上使用常见定义的细胞类型类别的性能。

仍然迫切需要开发针对微阵列数据的特定方法。当前针对微阵列数据的方法与先前 RNA-seq 研究中报告的方法之间仍存在显著性能差距——即基于我们的发现，微阵列的估计比例与真实比例之间的相关性通常低于 0.75，而先前研究中 RNA-seq 的相关性超过 0.9。尽管如此，这种差异应谨慎解读，因为这是间接比较，而非使用相同样本和相同单细胞参考对微阵列和 RNA-seq 进行的头对头评估。几个技术因素可能导致这种差异。微阵列平台的动态范围更有限，容易发生信号饱和和交叉杂交，并且可能遗漏 RNA-seq 捕获的低表达或细胞类型特异性标记基因。此外，微阵列平台的基因覆盖通常与 scRNA-seq 来源的标记集不完全重叠，可能降低反卷积的有效分辨率。微阵列和 RNA-seq 之间在噪声结构、归一化程序和批次效应方面的差异可能进一步影响模型性能。这些因素共同解释了为什么在基于 RNA-seq 的基准测试中表现良好的算法在应用于使用 scRNA-seq 来源参考的微阵列数据时准确率降低。

总之，细胞类型反卷积在健康与疾病状态下的细胞功能和相互作用方面具有提供生物学洞察的巨大潜力。尽管单细胞 RNA 测序现在提供了直接的细胞水平分辨率，但细胞类型反卷积对于分析主导公共存储库的大规模批量转录组数据集以及在单细胞分析因成本、组织可用性或保存限制而不可行的情况下仍然至关重要。此外，反卷积通过实现跨研究比较和独立队列中的验证来补充单细胞数据。在此背景下，细胞类型反卷积正成为转录组数据系统级解释不可或缺的分析方法。

更复杂和准确的反卷积方法的持续发展将是充分利用转录组数据潜力的关键。研究人员越来越能够整合批量数据和单细胞数据来揭示组织结构的复杂性，从而产生更精确的细胞行为和相互作用模型。这反过来又为考虑个体患者组织独特细胞组成的诊断工具、靶向治疗和个性化医疗方法铺平了道路。

研究的局限性

我们的研究可能在未来工作中从几个方面得到补充：i）由于 FACS 分离的批量微阵列数据中具有已知细胞类型且每个样本可用的数据有限，我们只能测试一个微阵列数据集进行评估。未来的工作可能考虑其他数据集和组织；ii）应研究不同细胞类型预测性能变异性的其他假设，以探索原因并改进预测算法的结果；iii）为了充分保持所应用算法的可比性以及使用每个组织特异性 scRNA-seq 数据集作为参考的潜力，我们纳入了可以接受参考作为输入的基于参考的算法。我们排除了基于其他数据类型（例如空间转录组学）或针对特定组织或疾病的方法。未来的工作也可能聚焦于无参考算法或基于预定义参考（如 xCell）的算法，同时确保结果的可比性。

资源可用性

主要联系人

有关进一步信息和资源的请求应直接联系主要联系人 Ahmad Vaez 博士（[e-mail]），并将由其负责处理。

材料可用性

本研究未产生新的独特试剂。

数据和代码可用性

• 包含 114 个血细胞类型样本的微阵列数据集可通过 Gene Expression Omnibus（GEO）公开获取，登录号为 GEO：GSE22886。单细胞 RNA-seq 参考数据集可从 10x Genomics 公开获取（PBMC3k 和 PBMC8k 数据集，网址为 https://www.10xgenomics.com/）。
• 本研究中使用的所有工具均可作为 R 包、独立软件或基于网页的工具公开获取。CIBERSORTx 可在 https://cibersortx.stanford.edu/ 获取。MuSiC 和 Scaden 分别在 GitHub 上提供，网址为 https://github.com/xuranw/MuSiC 和 https://github.com/KevinMenden/scaden。其他反卷积算法可通过 granulator R 包在 https://github.com/Novartis/granulator 获取。
• 重新分析本文报告数据所需的任何其他信息均可向主要联系人索取。

致谢

资金支持由伊斯法罕医科大学提供（项目编号 2403356），授予 Ahmad Vaez 博士和 Zoha Kamali 博士。

我们感谢格罗宁根大学信息技术中心的支持以及提供 Hábrók 高性能计算集群的访问权限。

作者贡献

Z.K.：概念化、方法学、验证、正式分析、调查、资源、数据管理、写作——初稿、可视化。A.V.：监督、项目管理、写作——审阅和编辑、资金获取。H.S.：监督、项目管理、写作——审阅和编辑。

利益冲突声明

作者声明他们没有竞争利益。

稿件准备过程中使用生成式 AI 和 AI 辅助技术的声明

在准备本工作期间，作者使用 ChatGPT（OpenAI）来改进语言和可读性、完善写作并生成图形摘要。使用该工具后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对出版物的内容承担全部责任。本手稿中的所有科学内容、数据分析、图表、图解释和结论完全由作者生成，未使用生成式 AI 工具。

STAR★方法

关键资源表

| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| 沉积数据 | | |
| 用于基准测试的主要 scRNAseq 参考面板 | 10x Genomics 数据存储库 https://cf.10xgenomics.com/samples/cell/pbmc3k/pbmc3k_filtered_gene_bc_matrices.tar.gz | PBMC3k |
| 用于验证的 scRNAseq 参考面板 | 10x Genomics 数据存储库 https://cf.10xgenomics.com/samples/cell-exp/2.1.0/pbmc8k/pbmc8k_filtered_gene_bc_matrices.tar.gz | PBMC8k |
| 包含 114 个样本的批量微阵列数据集 | GEO 数据库 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE22886 | GEO：GSE22886 |
| 软件和算法 | | |
| CIBERSORTx | https://cibersortx.stanford.edu/ | N/A |
| MuSiC | https://github.com/xuranw/MuSiC | N/A |
| Scaden | https://github.com/KevinMenden/scaden | N/A |
| granulator | https://github.com/Novartis/granulator | N/A |

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实验模型和研究参与者详细信息

本研究是对先前生成且公开可用的转录组数据的计算分析，不涉及招募或与人类参与者的直接互动。本工作已获得伊斯法罕医科大学和卫生服务研究伦理委员会的批准（IR.MUI.REC.1404.017）。

方法详情

输入数据

scRNAseq 参考面板

来自健康人类供体的 2,700 个细胞的标准外周血单核细胞（PBMC），由 10x Genomics 技术生成（可在 cf.10xgenomics.com 获取），并作为 Seurat 流程中的教程使用（https://satijalab.org/seurat/articles/pbmc3k_tutorial），被用作 scRNAseq 参考来估计批量数据中的细胞类型组成（下载链接：https://cf.10xgenomics.com/samples/cell/pbmc3k/pbmc3k_filtered_gene_bc_matrices.tar.gz）。为了独立验证，使用了来自同一资源的另一个健康供体的 8k 细胞 PBMC 数据（下载链接：https://cf.10xgenomics.com/samples/cell-exp/2.1.0/pbmc8k/pbmc8k_filtered_gene_bc_matrices.tar.gz）。

微阵列数据

为了对应用于批量微阵列数据的不同细胞类型反卷积算法进行基准测试，我们需要具有已知细胞类型组成的微阵列样本，以比较真实与估计的细胞类型组成。因此，我们使用了一个包含来自正常人类供体的 114 个外周血和骨髓样本的微阵列数据集，代表九种广泛细胞类型。每种细胞类型均通过 FACS 技术分离和纯化（GEO：GSE22886）。这九种细胞类型——B 细胞、CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞、NK 细胞、单核细胞、中性粒细胞、树突状细胞、浆细胞和记忆 T 细胞——是数据集中唯一可用的类型，因此定义了我们的基准分析范围。

预处理

scRNAseq 参考面板

在应用标准数据预处理步骤（使用 Seurat R 包去除低质量细胞：nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 2500 & percent.mt < 5）后，准备了两个版本的数据：i）原始计数；ii）使用默认比例因子 10,000 进行对数归一化的计数。这两个版本首先使用 granulator R 包的细胞类型相似性矩阵以及 CIBERSORTx 提供的热图和层次聚类进行评估。这两个参考数据集随后用于构建预测参考，以进行细胞类型反卷积算法的性能比较（补充材料）。

微阵列数据

考虑两个影响预测准确率的主要参数：数据归一化以及将批量数据与参考 scRNAseq 数据匹配时如何处理被多个探针标记的基因（以下称为“多探针基因”）。因此，我们准备了该数据的五个版本：i) 所有探针的原始数据，ii) 单探针基因的原始数据，iii) 单探针基因的原始数据以及多探针基因中随机选择的探针，iv) 单探针基因的原始数据以及基于微阵列与参考scRNAseq之间的最佳相关性探针（针对多探针基因），以及v) 所有探针的分位数归一化（QN）数据。在所有分析中，输入的微阵列表达值均为线性尺度，与GEO提供的数据一致。最佳相关性探针的选择策略详见补充材料。分位数归一化使用limma R包中的normalizeBetweenArrays函数完成。随后，我们利用这些已知细胞类型的批量数据，比较了不同算法在预测这些样本细胞类型组成方面的性能。

**匹配两个数据集**

接下来，我们试图通过匹配两个数据集中的细胞类型和基因来减少输入数据集与参考数据集之间的差异对方法比较的影响。首先，移除scRNAseq参考数据中未覆盖的细胞类型的微阵列样本，剩余102个样本。其次，逐一检查其余细胞类型，使其与参考数据精确匹配。如果批量样本代表宽泛的细胞类型而参考数据包含更具体的亚型，我们根据其表达谱将批量样本划分为相应的亚型，以匹配参考数据的分辨率。第三，根据GEO数据库提供的平台注释文件（即GPL96）将探针与基因匹配。我们使用两个数据集共有的基因，基于每种方法的默认参数进行解卷积。

**方法性能比较**

**分析条件**

比较不同方法所采用的分析条件设计如下：1) 从线性或对数转换的参考数据中选择最佳版本；2) 在探针匹配和分位数归一化状态方面选择微阵列数据的最佳版本。对于第一个目的，比较了两个条件：a) 以线性scRNAseq数据（即对数转换前的过滤数据）为参考，以原始微阵列数据为输入批量数据集；b) 以对数归一化的scRNAseq数据为参考，以原始微阵列数据为输入批量数据集。对于第二个目的，比较了五个条件，其中使用线性scRNAseq数据作为参考，上述五个版本的微阵列数据作为输入批量数据集。

在准备和匹配批量数据与scRNAseq数据后，比较了十种细胞类型解卷积算法的性能，包括多受试者单细胞解卷积（MuSiC）、细胞类型鉴定扩展版（CIBERSORTx）、单细胞辅助解卷积深度神经网络（Scaden）、非负最小二乘回归模型（nnls）、普通最小二乘（ols）、无约束二次规划（qprog）、具有非负性和和为1约束的二次规划（qprogwc）、线性混合模型（dtangle）、重加权最小二乘（rls）和支持向量回归（svr）。比较在六种条件下进行：1–4) 使用scRNAseq参考的原始计数和所有探针、仅单探针基因、单探针基因加多探针基因随机选择的探针、或单探针基因加微阵列与参考scRNAseq之间最佳相关性探针（针对多探针基因）的原始批量数据；5) 使用scRNAseq参考的原始计数和所有探针的分位数归一化（QN）批量数据；6) 使用scRNAseq参考的对数归一化计数和所有探针的原始批量数据。我们还在最基本的条件下（原始批量数据和原始参考数据）比较了这些算法在不同细胞类型上的性能，并探讨了参考数据中细胞类型的覆盖度是否影响预测性能。最后，我们对第一轮比较中表现最佳的方法进行了重复比较，这次使用性能最佳的数据版本组合。

皮尔逊相关系数（r）以及这些估计值的均方根误差（RMSE）是这两个比较的评判标准。

为了独立验证，使用PBMC8k scRNA-seq数据集重复了所有这些比较。

**模拟伪批量混合物**

我们还生成了1000个输入微阵列数据的伪批量混合物，以在更接近真实条件的样本中评估解卷积算法，即这些样本是细胞类型的混合物而非纯化的细胞类型。由于基于微阵列的数据是基因表达计数向表达强度的投影，我们使用不同细胞比例下表达的加权求和来计算批量表达：

GE(i)x = ∑(k=1 to n) Pi.k × GEx.k

其中GE(i)x表示样本i中基因x的模拟批量基因表达值，n是构成混合物的细胞类型总数，Pi.k表示样本i中细胞类型k的比例，GEx.k是细胞类型k中基因x的基因表达值。

我们没有假设每种细胞类型在模拟混合物中具有固定的表达谱（GEx.k）。对于每种细胞类型在每个混合物中，从可用样本中随机选择一个该细胞类型的FACS分选微阵列样本。因此，不同的模拟混合物可能包含同一细胞类型的不同实验观察表达谱，从而融入了经验性的样本间变异。

为了引入额外的基因水平随机变异，所得混合物谱随后使用乘法对数正态误差项进行扰动：

GE'(i)x = GE(i)x × exp(ε(i)x)

其中ε(i)x ~ N(0, σ2)，σ = 0.01。该方法引入正的、基因特异性的乘法变异，同时保留底层的表达信号和已知的细胞类型比例。

解卷积方法使用的参考特征矩阵是原始的PBMC3k scRNA-seq参考数据集。

**运行时间和内存使用比较**

为了帮助确定哪种算法最符合用户需求，我们还比较了每种算法所需的运行时间和峰值内存使用量，使用相同的输入数据独立进行。所有可在本地环境执行的方法（基于R的和命令行工具）均在相同的计算条件下进行基准测试。

**量化与统计分析**

**性能评估**

通过将估计的细胞类型比例与相应的真实比例进行比较来评估解卷积性能。对于FACS分选的微阵列样本，使用预测与观察的细胞类型比例之间的皮尔逊相关系数（r）和均方根误差（RMSE）来评估性能。皮尔逊相关系数用于量化相对细胞类型比例的一致性，而RMSE用于量化预测误差的大小。对于伪批量分析，使用生成每个合成混合物时已知的比例作为真实值来计算相同的性能指标。

**自举不确定性估计**

为了量化性能指标中的不确定性，在样本水平上采用了非参数自举方法。对于每个方法-条件组合，通过有放回重采样生成1000个自举重复。对于每个重复，重新计算r和RMSE，并使用经验2.5%和97.5%分位数推导95%置信区间（CI95%）。

**解卷积算法的统计比较**

使用Friedman检验评估方法间的整体性能差异，同时考虑预处理条件下的重复测量。

在Friedman检验显著（p < 0.05）之后，使用Conover事后检验进行方法间的两两比较，并进行适当的多重比较校正（p < 0.001，即0.05/45，其中45为两两检验的数量）。

**细胞类型丰度分析**

对于伪批量混合物，还根据相应细胞类型的丰度评估了解卷积性能。细胞类型比例被分为五个丰度组：极罕见（<0.01）、罕见（0.01–0.05）、低（0.05–0.10）、中等（0.10–0.20）和高（>0.20）。在每个丰度组内分别计算皮尔逊相关系数和RMSE，以评估细胞类型丰度对预测性能的影响。

**计算性能**

运行时间和内存测量结果在重复运行中汇总，相应的均值和变异估计值在相关图及补充材料中报告。

每项基准测试重复11次，丢弃第一次运行以减少初始化的潜在影响，随后10次运行用于汇总统计。

**补充信息（2）**

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文件S1. 图S1–S8，表S1–S3，方法S1
电子表格（13.39 KB）
数据S1. 图3d的源数据