《Horticulturae》：Integrated Transcriptomic and Proteomic Analysis Provides Insights into Sepal Doubling in Ornamental Pomegranate
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石榴（Punica granatum）萼片重瓣化以花萼开裂和双层结构形成为特征，赋予其独特的观赏价值，但其发育机制尚不清楚。阐明石榴萼片重瓣化的分子机制并筛选相关基因和蛋白质具有理论和实践意义。本研究对单瓣花、重瓣花和增殖花的萼片进行了转录组学和蛋白质组学分析
石榴（Punica granatum）萼片重瓣化以花萼开裂和双层结构形成为特征，赋予其独特的观赏价值，但其发育机制尚不清楚。阐明石榴萼片重瓣化的分子机制并筛选相关基因和蛋白质具有理论和实践意义。本研究对单瓣花、重瓣花和增殖花的萼片进行了转录组学和蛋白质组学分析，共鉴定到23,630个基因和5,803个蛋白质，其中5,634个在两种水平上均被定量。两两比较显示，差异表达基因（DEGs）与差异丰度蛋白（DAPs）之间的相关性高于总基因集与总蛋白集之间的相关性。由于SeSi与SeDo/SePr来源于不同品种，SeSi比较部分受基因型混杂影响，而SeDo与SePr比较受品种影响最小。在转录组、蛋白质组和整合数据集中均检测到细胞壁相关条目，同时转录组比较中光合作用相关条目占主导。共鉴定到11个细胞壁代谢相关DEGs和3个细胞壁代谢相关DAPs，包括10对一致的DEG–DAP对。这些候选因子既包含一致的DEG–DAP对，也包含仅在单一组学水平得到支持的因子。其中，纤维素合酶A（CESA）、延伸蛋白-2（EXT2）、内切-1,4-β-D-葡聚糖酶（EG）和木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶16（XTH16）与双层花萼形成相关，而果胶酯酶（PE）、α-半乳糖苷酶（α-Gal）、木聚糖α-葡萄糖醛酸转移酶（α-GLU）和多聚半乳糖醛酸酶（PG）与花萼开裂相关。两种蛋白质修饰酶，即丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（STPK）和丝氨酸羧肽酶（SCP），与花萼开裂相关。此外，两个转录因子，即碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）和冷休克域蛋白（CSD），与萼片重瓣化相关。这些发现为石榴花发育和花型改良的进一步研究提供了分子基础。
论文解读：观赏石榴萼片重瓣化的整合转录组与蛋白质组研究
一、研究背景与科学问题
花萼作为花器官最外层的轮生结构，对花芽、花朵和果实起支撑与保护作用，其形态特征与萼片持久性、果实脱落和裂果等性状密切相关。在植物中，萼片形态变异可形成独特的花型和果型，例如绣球花的萼片呈花瓣状，酸浆的宿存萼膨大形成灯笼状结构包裹果实。现有关于萼片形态发生的研究主要集中于萼片形状变异和萼片花瓣化转变，涉及的分子机制包括WUS–CLV3反馈环失衡导致干细胞池过度维持、CUC1–生长素互作紊乱引起原基起始和平面极性失控，以及B类MADS-box基因异位表达导致萼片身份花瓣化。这些过程涉及细胞壁重塑、转录因子调控和激素调控。
观赏石榴（Punica granatum）属于千屈菜科，其花一般分为单瓣花（六枚花瓣）、重瓣花（数十至数百枚花瓣）和增殖花（花中花）三种类型，相应的萼片也呈现三种形态：单瓣花具有六枚不分裂萼片；重瓣花萼片发生连续不规则开裂；增殖花萼片除连续不规则开裂外还形成双层结构。目前对石榴萼片的研究仅涉及赤霉素生物合成基因和YABBY转录因子家族成员，而萼片开裂和双层结构形成的机制仍不清楚。转录组和蛋白质组技术能够分别刻画RNA和蛋白质的表达谱，二者整合可在转录和翻译水平上提供基因功能、表达模式和代谢途径的互补信息。然而，此前尚无整合转录组-蛋白质组研究探讨观赏石榴萼片重瓣化。为此，研究人员对单瓣、重瓣和增殖花萼片开展转录组、蛋白质组及整合分析，以期从多组学角度揭示萼片开裂和双层花萼形成的分子基础，并为培育观赏石榴新品种提供理论基础。
二、研究内容与主要结论
研究人员于2019年5月5日在南京林业大学（32°4′38″ N, 118°49′5″ E）采集单瓣花萼片（SeSi，品种‘Nldbh’）以及重瓣花萼片（SeDo）和增殖花萼片（SePr，品种‘Nlcbh’）。每种花型设三个生物学重复，每个重复对应一株独立植株，每株取三朵花，将其萼片混合为一个样本；SePr的外层和内层萼片等量混合。同一混合样本同时用于转录组和蛋白质组分析。研究人员对三个萼片类型进行了mRNA和蛋白质丰度的两两比较，对差异表达基因（DEGs）和差异丰度蛋白（DAPs）进行富集分析，并结合候选基因的表达模式分析。共鉴定到23,630个基因和5,803个蛋白质，其中5,634个在两种水平均被定量。两两比较显示，DEGs与DAPs之间的相关性高于总基因和总蛋白之间的相关性。由于SeSi与SeDo/SePr来自不同品种，SeSi比较部分受基因型混杂影响，而SeDo对SePr比较受品种影响最小。细胞壁相关条目在转录组、蛋白质组和整合数据集中均有检出，同时转录组比较中光合作用相关条目占主导。共鉴定到11个细胞壁代谢相关DEGs和3个细胞壁代谢相关DAPs，包括10对一致的DEG–DAP对。其中，纤维素合酶A（CESA）、延伸蛋白-2（EXT2）、内切-1,4-β-D-葡聚糖酶（EG）和木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶16（XTH16）与双层花萼形成相关；果胶酯酶（PE）、α-半乳糖苷酶（α-Gal）、木聚糖α-葡萄糖醛酸转移酶（α-GLU）和多聚半乳糖醛酸酶（PG）与花萼开裂相关；丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（STPK）和丝氨酸羧肽酶（SCP）也与花萼开裂相关；碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）和冷休克域蛋白（CSD）与萼片重瓣化相关。这些发现鉴定了与萼片重瓣化相关的候选分子过程、基因和蛋白质，为观赏石榴的花发育和花型改良研究提供了基础。
三、关键技术与方法
本研究采用了以下主要技术方法：（1）转录组测序：采用BGISEQ-500平台进行RNA测序（PE100），利用HISAT比对到‘Dabenzi’参考基因组，RSEM定量基因表达水平，StringTie组装转录本，并通过qRT-PCR验证RNA-seq数据可靠性。（2）蛋白质组分析：采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，使用Q Exactive Plus质谱仪，MaxQuant软件搜索Punica_granatum数据库进行蛋白质鉴定和定量。（3）生物信息学整合分析：使用edgeR进行转录组差异表达分析，基于肽段计数和LFQ强度进行蛋白质差异丰度分析，利用OmicShare进行GO富集分析，并计算转录-蛋白质相关性。样本来源于南京林业大学校园内的两个观赏石榴品种，每个品种三株独立植株，每株三朵花混合为一个生物学重复。
四、研究结果详解
1. 观赏石榴萼片重瓣化表型
单瓣、重瓣和增殖花的花萼形态与萼片表型密切相关。开花期间，单瓣花萼片保持不分裂，重瓣和增殖花萼片发生连续不规则开裂；增殖花萼片逐渐形成两层，萼片数量约增加一倍。重瓣和增殖花的萼片长度和宽度显著大于单瓣花。盛花期平均萼片数分别为单瓣花6.22、重瓣花7.11、增殖花13.45。SeSi对SeDo比较用于分析萼片开裂相关差异，SeDo对SePr比较用于分析双层结构形成相关差异，SeSi对SePr比较用于分析两种特征共同相关差异。
2. 转录组测序基本信息
转录组测序共产出58.49 Gb clean data，Q20值大于96.27%，与‘Dabenzi’参考基因组的比对率为92.29%–93.28%。共检测到23,630个基因，包括2,846个新基因。三个萼片类型中分别定量到21,105、20,319和20,437个基因。生物学重复间相关性高，表明数据可靠。
3. 萼片重瓣化相关DEGs
SeSi对SeDo、SeDo对SePr和SeSi对SePr比较中分别鉴定到4,926、2,865和3,505个DEGs，其中382个DEGs为三个比较共有。GO富集分析显示，不同萼片类型间DEGs主要富集于光合作用和细胞壁代谢相关条目。
4. 与萼片重瓣化相关的候选DEGs
共鉴定到11个细胞壁代谢相关DEGs，包括extensin-2（EXT2）、木葡聚糖转移酶（XTR）、葡糖醛酸木聚糖4-O-甲基转移酶（GXM）、木聚糖α-葡萄糖醛酸转移酶（GUX）、多聚半乳糖醛酸酶（PG）、三个纤维素合酶A（CESA）基因和三个果胶酯酶（PE）基因。另鉴定到14个转录因子基因，属于AP2-EREBP、bHLH、CSD、G2-like、LOB、MYB、NAC、SRS、TCP和WRKY家族。bHLH（CDL15_Pgr024315）从单瓣到重瓣到增殖花表达逐渐升高，CSD（CDL15_Pgr019669）逐渐降低。
5. 转录组数据验证
对9个基因进行qRT-PCR验证，qRT-PCR与RNA-seq的log2FC相关系数介于0.718至1.000之间，证实转录组数据可靠。
6. 蛋白质组基本概况
LC-MS/MS分析共产出1,699,841张谱图，其中321,270张有效，鉴定到48,604个肽段（包括42,022个唯一肽段），共鉴定到5,803个蛋白质，其中5,641个被定量。主成分分析和Pearson相关分析显示生物学重复聚类紧密、重现性高。
7. 萼片重瓣化相关候选DAPs
SeSi对SeDo、SeDo对SePr和SeSi对SePr比较中分别鉴定到118、234和313个DAPs，其中8个DAPs为三个比较共有。GO富集分析表明三个比较的DAPs均富集于细胞壁代谢相关条目。共有的8个DAPs中，STPK在SeDo和SePr中丰度高于SeSi；EG和XTH16在SePr中丰度高于SeSi和SeDo；PE在SeDo和SePr中相对于SeSi下调。
8. 转录组与蛋白质组整合分析
三个萼片类型间蛋白质水平的相关性高于转录组水平。SeSi对SeDo、SeSi对SePr和SeDo对SePr比较中，差异调控的基因-蛋白对分别为104、81和109对，相关系数分别为0.687、0.397和0.658；其中在两种水平均差异调控的分别为47、41和53对，相关系数为0.732、0.499和0.660。表现一致趋势的差异调控对分别为42、30和52对，相关系数为0.813、0.897和0.687。GO富集分析显示一致性DEG–DAP对富集于细胞壁代谢与组装以及丝氨酸羧肽酶（SCP）活性相关条目。共鉴定到10个细胞壁相关DEG–DAP对，包括3个PE、XTH8、CESA、α-Gal、α-GLU、颗粒结合淀粉合酶1、木葡聚糖半乳糖基转移酶2（XLT2）和PG。4个SCP相关DEG–DAP对中，SCP（CDL15_Pgr020972）在SeDo和SePr中的转录本和蛋白质水平显著高于SeSi。
五、讨论与结论
讨论部分指出，转录组和蛋白质组整合分析在三个萼片类型中共鉴定到23,630个基因和5,641个蛋白质，其中5,634个在两种水平均被定量。萼片类型间蛋白质水平相关性高于mRNA水平，表明转录水平上的差异大于蛋白质水平。细胞壁相关条目在转录组、蛋白质组和整合数据集中均有检出，而转录组比较中光合作用相关条目占主导。细胞壁代谢相关基因参与花药壁、花粉壁和柱头乳突等花发育过程。研究人员认为，CESA、EXT2、EG和XTH16与双层花萼形成相关；PE、α-Gal、α-GLU、PG、STPK和SCP与花萼开裂相关；bHLH和CSD与萼片重瓣化相关。研究存在局限性：SeSi来自品种‘Nldbh’，而SeDo和SePr来自品种‘Nlcbh’，因此涉及SeSi的比较部分受基因型混杂影响，SeDo对SePr比较受品种影响最小。此外，仅鉴定到候选基因和蛋白质，未进行功能验证。研究结论为：对SeSi、SeDo和SePr的转录组和蛋白质组分析鉴定了与萼片重瓣化相关的分子变化，细胞壁相关功能在三个数据集中均富集；两两比较显示DAPs与DEGs的相关性高于总基因和总蛋白集；候选因子中CESA、EXT2、EG和XTH16与双层花萼形成相关，PE、α-Gal、α-GLU、PG、STPK和SCP与花萼开裂相关，bHLH和CSD与萼片重瓣化相关；这些发现为观赏石榴花发育和花型改良的进一步研究提供了基础，未来需通过功能验证确认候选因子的作用。
