《Horticulturae》：A Simple and Highly Efficient Regeneration Protocol for Bougainvillea glabra: Achieving Callus Induction, Shoot Organogenesis, and Elongation on a Single Medium
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三角梅（Bougainvillea）是全球经济与园艺价值最高的开花灌木之一，但其遗传改良受到自然结实率低和胚胎败育频繁的严重制约。现有微繁殖方案主要依赖节段茎段，因而绕过全能性愈伤阶段，限制了其在分子育种和遗传操作中的应用。本研究系统评价并比较了B. glab
三角梅（Bougainvillea）是全球经济与园艺价值最高的开花灌木之一，但其遗传改良受到自然结实率低和胚胎败育频繁的严重制约。现有微繁殖方案主要依赖节段茎段，因而绕过全能性愈伤阶段，限制了其在分子育种和遗传操作中的应用。本研究系统评价并比较了B. glabra Choisy ‘Light Violet’幼叶与种子来源幼嫩下胚轴外植体的离体形态发生能力。尽管幼叶外植体在含2.0 mg/L 6-苄氨基嘌呤（6-BA）和0.2 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）的培养基上易于形成旺盛愈伤组织，但在所有测试条件下均未能分化为不定芽，表明其存在内在的形态发生障碍。与之形成鲜明对照，幼嫩下胚轴外植体成功克服该发育阻滞，建立了完整且高效的愈伤组织介导全株再生体系。在Murashige and Skoog（MS）培养基上测试的6种6-BA、2,4-D和激动素（KT）组合中，2.0 mg/L 6-BA与0.2 mg/L 2,4-D组合独特地诱导出紧凑、活跃分裂的愈伤组织，并于25天内自发启动芽原基，不定芽分化率达到最高，为90.4 ± 2.5%。再生芽在添加1.25 mg/L 1-萘乙酸（NAA）和0.75 mg/L 吲哚-3-丁酸（IBA）的1/2 MS培养基上生根最有效，生根率为95.2 ± 0.7%。关键在于，从下胚轴切段愈伤诱导、从头芽器官发生到茎伸长的整个发育序列均在统一单一培养基（2.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L 2,4-D）上协调完成，显著简化操作流程并提高增殖效率。该稳健方案为高效大规模繁殖提供了实用流程，并为三角梅未来遗传转化和分子育种建立了不可或缺的细胞基础。
研究背景与问题：三角梅（Bougainvillea）为全球重要开花灌木，约18个野生种经杂交、芽变和开放授粉筛选形成500余品种，兼具观赏、耐旱及苞片和叶中甜菜红素、黄酮和酚类等抗氧化、抗炎活性。但常规繁殖育种受窄花被筒所致结实率低和胚胎败育频繁制约，商业品种依赖偶然芽变，周期长；扦插和嫁接不能产生新变异且受基因型生根障碍和季节限制。已有微繁殖多利用节段茎段，依赖原有腋芽或潜伏芽，或止于非再生愈伤用于次生代谢物提取，绕过全能性愈伤；少数下胚轴研究依赖多阶段多培养基，且未系统比较成熟叶与幼嫩组织，也未解决愈伤诱导、从头芽器官发生和茎伸长能否在单一培养基协调的问题。故研究人员以B. glabra Choisy ‘Light Violet’比较幼叶与种子来源幼嫩下胚轴的形态发生能力，建立简单高效完整的愈伤介导全株再生体系，为遗传转化和分子育种提供细胞平台。
研究开展、结论与意义：研究人员系统评价叶与下胚轴外植体，优化激素配比和生根条件并完成驯化。结论为：幼叶可诱导并增殖愈伤但不能分化不定芽；下胚轴可突破阻滞，在2.0 mg/L 6-苄氨基嘌呤（6-BA）+0.2 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）单一培养基同步完成愈伤诱导、不定芽发生和茎伸长，分化率90.4 ± 2.5%，在1/2 Murashige and Skoog（MS）培养基+1.25 mg/L 1-萘乙酸（NAA）+0.75 mg/L 吲哚-3-丁酸（IBA）上生根率95.2 ± 0.7%并成功移栽。该体系简化流程，为B. glabra高效微繁殖及后续农杆菌转化、CRISPR/Cas9编辑和精准分子育种提供受体平台。
关键技术方法：供试B. glabra种子与供体植株取自三亚崖州湾科技城三角梅科技园，组织培养在海南省农业科学院三亚研究院组织培养实验室完成。比较幼叶与种子来源下胚轴：幼叶经1% NaClO消毒后接种27种6-BA/2,4-D或6-BA/NAA组合暗培养；下胚轴经无菌暗萌发10–14天获得，切段后接种6种6-BA、2,4-D和激动素（KT）组合；再筛选4种不定芽分化、壮芽和5种生根培养基，并完成开盖炼苗与灭菌土移栽。响应率以三次独立生物学重复的均值±标准偏差（SD）及合并响应比表示，用Fisher精确检验比较处理（p<0.001），并观察愈伤形态和芽/根活力。
研究结果：
3.1 叶外植体愈伤诱导与增殖但未分化不定芽：幼叶消毒后污染率<20%，80%以上存活；27种6-BA/2,4-D或6-BA/NAA组合均诱导愈伤，最佳增殖培养基c（2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D）获体积大、绿色、无褐化愈伤；转4种分化培养基均无不定芽，说明叶愈伤存在内在发育限制。
3.2 种子萌发与下胚轴外植体采集：黑暗萌发10–14天获4–5 cm无菌苗，去根和子叶切取0.5–1 cm下胚轴；种子组织污染低，适合作幼嫩外植体。
3.3 下胚轴愈伤诱导：6种激素组合均诱导愈伤但形态长势差异大；2 mg/L 6-BA+0.5或0.2 mg/L 2,4-D形成大而紧凑愈伤，后者第25天自发芽点；低6-BA愈伤量小，2.5 mg/L 2,4-D单用褐化并伴生根。愈伤诱导较不敏感，质量与发育能力高度依赖6-BA:2,4-D比例。
3.4 愈伤不定芽分化：2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D诱导的下胚轴愈伤转4种分化培养基，仅该组合诱导不定芽，时间短，分化率90.4 ± 2.5%；KT或NAA/吲哚-3-乙酸（IAA）组合只增大不成芽。中等细胞分裂素/生长素比且6-BA为主、低2,4-D是器官发生重定向关键。
3.5 壮芽与生根：不定芽在MS+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D上约30天形成8–10片真叶壮芽；5种生根培养基仅1/2 MS+1.25 mg/L NAA+0.75 mg/L IBA生根，生根率95.2 ± 0.7%，根系发达；其他失败。
3.6 驯化与移栽：生根苗经3–7天开盖炼苗，洗去植物凝胶（Phytagel）后移入灭菌土，30天后生长旺盛，成功瓶外（ex vitro）成苗；全程约115–125天，每外植体平均3–5株。
讨论总结与结论翻译：讨论认为，叶片与下胚轴均诱导愈伤，但仅下胚轴愈伤能在同一2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D及分化培养基再分化；该差异非未测试激素窗口，而反映组织发育能力内在差异，叶肉细胞终末分化，下胚轴幼嫩且分裂活跃，故排除叶片作为绕过低结实率构建转化感受态愈伤的捷径。2,4-D在诱导、增殖和分化中关键：叶诱导中6-BA+2,4-D优于6-BA+NAA；下胚轴统一培养基以2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D协调全程，其他生长素比例不能完成再生，提示Bougainvillea对2,4-D高度特异响应。与既往方案相比，Gong et al. 茎段方案芽分化率仅25.6%且需五种培养基，Lu et al. 需四种培养基且芽诱导81.3%、生根82.5%，Nasrat et al. (2022)仅将节段愈伤用于次生代谢物提取；本研究分化率90.4 ± 2.5%、生根率95.2 ± 0.7%，并优于Li et al. (2025)报道的66.7%生根率，且在单一培养基协调愈伤诱导、芽分化和茎伸长，符合Skoog & Miller生长素:细胞分裂素比例模型。未来需跨基因型验证、组织细胞学与流式/分子标记评估遗传稳定性，并测试农杆菌（Agrobacterium）介导转化及CRISPR/Cas编辑。
研究结论翻译：本研究初期以幼叶可诱导增殖愈伤，但完全不能发生不定芽器官发生；种子来源幼嫩下胚轴成功突破该发育阻滞，建立完整高效愈伤介导全株再生体系。优化方案实现紧凑愈伤诱导、高频从头新梢分化（90.4 ± 2.5%）、稳健生根（1/2 MS+1.25 mg/L NAA+0.75 mg/L IBA上95.2 ± 0.7%）和成功瓶外驯化。关键是从下胚轴愈伤诱导、芽分化到茎伸长的整个序列均在统一单一培养基（MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D）上协调，显著简化操作并提高效率。该方案不仅为B. glabra建立标准化高效微繁殖流程，也为未来农杆菌介导遗传转化、CRISPR/Cas9基因组编辑和精准分子育种提供不可或缺的细胞平台和受体系统。
