卢西塔尼亚克氏酵母M61挥发性有机化合物抑制番茄采后灰葡萄孢病害的研究

《Horticulturae》：Volatile Organic Compounds of Clavispora lusitaniae M61 Restrain Tomato Postharvest Botrytis cinerea

　　

： 由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的采后果实损失是制约番茄产业发展的关键因素之一。有益微生物，尤其是生物防治酵母菌，在采后灰葡萄孢（B. cinerea）的生物防治中发挥着重要作用。本研究获得了一株能够有效抑制番茄果实采后灰霉病的生物防治酵母菌株M61，并鉴定其为卢西塔尼亚克氏酵母（Clavispora lusitaniae）。M61产生的挥发性有机化合物（VOCs）对灰葡萄孢（B. cinerea）表现出显著的抑制作用。将M61挥发性有机化合物（VOCs）熏蒸与病原菌接种同时进行，可显著降低番茄果实的病情严重程度和病斑直径；此外，经M61挥发性有机化合物（VOCs）预熏蒸3天的番茄果实，在接种灰葡萄孢（B. cinerea）后5天，其病斑直径和病情严重程度均显著降低。M61挥发性有机化合物（VOCs）还显著提高了酚类和黄酮类物质含量，以及苯丙烷代谢途径相关基因SlPAL和SlF3H的转录水平。然而，M61挥发性有机化合物（VOCs）对番茄果实的失重率、可溶性固形物（TSS）和可滴定酸（TA）均无显著影响。综上所述，M61挥发性有机化合物（VOCs）能够抑制灰葡萄孢（B. cinerea），从而减轻番茄果实的灰霉病严重程度，可用于采后生物防治。

卢西塔尼亚克氏酵母M61挥发性有机化合物对番茄采后灰霉病的生物防治作用——论文解读

一、研究背景与意义

番茄是全球范围内种植最为广泛、经济价值最高的园艺作物之一，为人类饮食提供了丰富的维生素、抗氧化剂及其他功能性营养物质。然而，采收后的番茄果实在运输、冷藏和货架期过程中极易受到病原真菌的侵染，在不当的贮藏条件下经常发生严重的采后腐烂，这大大降低了果实品质和商品性，严重制约了番茄产业的可持续与高质量发展。

灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的番茄果实常见采后病害。该病原菌寄主范围广、环境胁迫耐受性强，可通过伤口或气孔侵染果实，并在低温高湿的贮藏条件下快速传播，造成大面积果实腐烂，显著降低受感染果实的商业价值，导致巨大的采后经济损失。目前，番茄灰霉病的防治仍主要依赖化学杀菌剂。然而，单一杀菌剂的重复使用已导致灰葡萄孢（B. cinerea）产生广泛的抗药性，加之农药残留、环境污染和生态破坏等问题，共同威胁着食品安全和人类健康。因此，探索安全、高效、无残留且环境友好的生物防治策略，已成为番茄采后灰霉病可持续管理的研究重点。

生物防治酵母菌是一类在水果采后病害环境友好型管理中具有巨大潜力的有益微生物。已有研究表明，其抗真菌作用机制主要包括：与病原菌竞争营养物质和空间资源、分泌胞外抗菌物质、诱导寄主系统抗性，以及产生介导非接触抗真菌活性的挥发性有机化合物（VOCs）。作为气态生物活性代谢产物，微生物挥发性有机化合物（VOCs）能以气态形式抑制真菌生长并调节果实生理代谢，是水果采后病害环境友好型管理的宝贵资源。VOCs熏蒸可有效避免传统采后操作（如清洗和干燥）造成的物理损伤以及随之而来的腐烂损失。

近年来，大量研究证实了酵母VOCs在采后病害管理中的显著功效。例如，Naganishia sp.酵母产生的VOCs可显著抑制灰葡萄孢（B. cinerea）菌丝生长、分生孢子萌发及番茄果实灰霉病的发生率；Metschnikowia pulcherrima产生的挥发性物质可有效抑制灰葡萄孢（B. cinerea）的生长并显著降低采后果实腐烂发生率；Hanseniaspora uvarum产生的VOCs熏蒸可显著降低草莓果实腐烂发生率并延长货架期。此外，Wickerhamomyces anomalus产生的VOCs可有效调节番茄果实的生理代谢，提高抗坏血酸和番茄红素含量，增强果实抗氧化能力。Hanseniaspora uvarum分泌的VOCs还能显著促进草莓果实中酚类和黄酮类等防御相关次生代谢物的积累，进一步表明酵母VOCs不仅能直接抑制病原菌，还能作为信号分子调节果蔬生理代谢并诱导寄主抗性反应。

本研究分离获得了一株生物防治酵母菌M61，初步的番茄果实浸渍试验显示了其对灰霉病的抑制活性，体外实验进一步证实其对灰葡萄孢（B. cinerea）的抗真菌作用主要通过VOCs产生来实现。以往许多研究表征了酵母来源VOCs的抗真菌效力，但相对较少的研究在单一酵母-VOCs系统中同时评估生物防治性能和寄主防御触发能力。本研究全面评估了M61 VOCs对灰霉病的生物防治效果及其触发番茄果实寄主防御反应的能力，旨在阐明M61 VOCs作为一种安全、无残留、环境友好的气态策略在番茄采后灰霉病管理中的应用潜力，并为理解生物防治酵母菌、病原菌和寄主果实之间的相互作用奠定理论基础。

二、主要关键技术方法

研究人员从健康柑橘果皮中分离获得生物防治酵母菌株M61，通过26S rDNA PCR扩增、NCBI BLAST同源性分析和MEGA 12软件构建系统发育树进行分子鉴定。体外抗真菌试验采用平板对峙法和双皿法评估M61及其VOCs对灰葡萄孢（B. cinerea）的抑制作用。番茄果实接种试验包括果实表面消毒、针刺伤口接种灰葡萄孢（B. cinerea）孢子悬浮液（1×10⁶ conidia·mL^-1）、酵母悬浮液浸渍处理、M61 VOCs同时熏蒸接种处理以及M61 VOCs预熏蒸3天后再接种处理。果实生理指标测定包括失重率、可溶性固形物（TSS）含量（手持折光仪法）和可滴定酸（TA）含量（酸碱滴定法）。抗性相关指标测定包括黄酮相对含量（亚硝酸钠-硝酸铝比色法，以芦丁当量RE表示）和总酚相对含量（Folin-Ciocalteu法，以没食子酸当量GAE表示）。苯丙烷代谢途径相关基因SlPAL和SlF3H的表达水平通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析，以SlActin为参考基因，采用2^-ΔΔCt法计算相对表达量。

三、研究结果

3.1 生物防治酵母菌M61增强番茄果实对灰霉病的抗性

研究人员获得一株生物防治酵母菌M61，通过将番茄果实浸渍于酵母悬浮液后接种灰葡萄孢（B. cinerea）来评估其对番茄灰霉病的防治效果。与无菌水处理的对照组相比，浸渍M61悬浮液的番茄果实在接种后5天的病情严重程度显著降低，病斑直径也显著减小。序列比对显示M61与卢西塔尼亚克氏酵母（Clavispora lusitaniae）具有100%的序列同一性，系统发育分析进一步确认M61与卢西塔尼亚克氏酵母（Clavispora lusitaniae）聚为一支。

3.2 M61 VOCs对灰葡萄孢（B. cinerea）表现出抑制作用

为评估M61对灰葡萄孢（B. cinerea）的抗真菌活性，研究人员进行了平板对峙法和双皿法试验。平板对峙试验显示，培养5天后M61周围未观察到明显的抑菌圈。在双皿法中，与对照组相比，M61 VOCs处理组的灰葡萄孢（B. cinerea）菌落扩展明显更小，菌落直径显著减小，表明M61产生的VOCs抑制了灰葡萄孢（B. cinerea）的菌丝生长。

3.3 M61 VOCs同时熏蒸可控制番茄灰霉病

为进一步研究M61 VOCs对番茄灰霉病的影响，研究人员将番茄果实与灰葡萄孢（B. cinerea）孢子悬浮液接种同时进行M61 VOCs熏蒸处理，对照组用空白YPD平板熏蒸。与对照组相比，M61 VOCs处理组在接种后5天的病情严重程度显著降低，病斑直径也显著减小，表明M61 VOCs有效抑制了番茄果实的灰霉病。

3.4 M61 VOCs预熏蒸降低番茄果实灰霉病严重程度

为确定M61 VOCs是否能诱导番茄果实产生抗性，研究人员将果实先用M61 VOCs熏蒸3天，经无菌水冲洗、风干后再接种灰葡萄孢（B. cinerea）孢子悬浮液。与空白YPD平板熏蒸的对照组相比，预熏蒸果实在接种后5天的病情严重程度显著降低，病斑直径也显著减小，证明预熏蒸处理减轻了番茄果实的病害症状。

3.5 M61 VOCs处理对番茄果实失重率、TSS和TA无显著影响

为评估M61 VOCs熏蒸对番茄果实生理指标含量的影响，研究人员在熏蒸3天后计算了失重率，并测定了TSS含量和TA含量。与对照组相比，M61 VOCs处理在熏蒸3天后的失重率无显著差异，对可溶性固形物（TSS）和可滴定酸（TA）含量也无显著影响。

3.6 M61 VOCs对黄酮和总酚相对含量及苯丙烷途径基因表达的影响

为进一步研究M61 VOCs熏蒸对番茄果实代谢相关指标的影响，研究人员在熏蒸处理后测定了黄酮相对含量（以芦丁当量RE表示）和总酚相对含量（以没食子酸当量GAE表示）。与对照组相比，M61 VOCs处理组的黄酮和总酚相对含量在熏蒸后3天均显著升高，番茄果实中苯丙烷代谢途径相关基因SlPAL和SlF3H的表达水平在VOCs处理后也显著上调。

四、讨论与结论

讨论部分指出，酵母菌因其生物安全性、定殖能力和环境胁迫耐受性，已逐渐成为果蔬采后病害防治的研究热点和有效生物防治资源。其中，卢西塔尼亚克氏酵母（Clavispora lusitaniae）近年来受到越来越多的关注，已有研究证实不同卢西塔尼亚克氏酵母（Clavispora lusitaniae）菌株对多种采后真菌病害（包括柑橘绿霉病及其他由植物病原真菌引起的果实腐烂病）具有稳定的生物防治效果。然而，现有关于卢西塔尼亚克氏酵母（Clavispora lusitaniae）的报道大多集中于其基于定殖的拮抗机制，而其VOCs介导的抗真菌活性，尤其是VOCs预熏蒸后的寄主反应，受到的关注相对较少。本研究表明，M61 VOCs能抑制番茄灰霉病并触发番茄果实一系列抗性相关生理指标，在番茄采后灰霉病环境友好型管理中显示出良好的应用潜力。作为新筛选的生物防治酵母菌株，M61为研究VOCs介导的采后真菌病害生物防治提供了有价值的候选材料。虽然本研究验证了M61 VOCs的良好生物防治效果，但关键的生物活性挥发性化合物尚未表征，未来需要系统的实验来鉴定和验证这些挥发性物质。

研究结论：本研究表明，鉴定为卢西塔尼亚克氏酵母（Clavispora lusitaniae）的生物防治酵母菌株M61产生的VOCs可有效抑制番茄灰霉病。具体而言，接种后M61 VOCs熏蒸显著抑制了灰霉病的发展。此外，接种前用M61 VOCs预熏蒸果实也能减轻病害严重程度，同时促进酚类和黄酮类物质的积累并上调苯丙烷代谢途径中的关键基因，而果实失重率、可溶性固形物（TSS）和可滴定酸（TA）均无显著差异。