《Insects》：Mitogenomic Phylogeny, Divergence Times, and Ancestral Range Reconstruction of the Rolled-Winged Stonefly Family Leuctridae (Plecoptera: Nemouroidea)
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Leuctridae科是物种丰富且呈全北区分布的襀翅目（Plecoptera）类群，其系统发育关系、多样化时间线及生物地理学历史仍缺乏充分解析。研究人员组装了包含30个物种（代表目前公认12属中的9属）的线粒体数据集，整合了完整与近完整线粒体基因组（mitog
Leuctridae科是物种丰富且呈全北区分布的襀翅目（Plecoptera）类群，其系统发育关系、多样化时间线及生物地理学历史仍缺乏充分解析。研究人员组装了包含30个物种（代表目前公认12属中的9属）的线粒体数据集，整合了完整与近完整线粒体基因组（mitogenomes）以及从转录组（transcriptomes）中提取的线粒体基因，并纳入9个外群，以重建该科的系统发育、分化时间与祖先分布区。分析强力支持Leuctridae的单系性（monophyly），并恢复Megaleuctra为最早分化的谱系，随后为两个主要Leuctrinae分支：(Despaxia + Leuctra) + Moselia 与 (Paraleuctra + Pomoleuctra) + (Perlomyia + Rhopalopsole + Zealeuctra)。分子定年将科的冠群起源置于晚三叠世205.9 Ma（百万年前；95%最高后验密度[highest posterior density, HPD]：178.1–237.0 Ma），现生属自晚白垩世至晚始新世发生多样化。在DIVALIKE + J模型下的祖先分布区重建支持北美西部（western North America）为冠群节点（相对概率0.59）及多数深部节点的祖先分布区，但存在较大不确定性。东亚与北美之间现存的间断分布最符合深时分布区持续（deep-time range persistence）与反复的奠基者事件定殖（founder-event colonization），并可能结合了古老的地理隔离（vicariance）。研究结果为Leuctridae多样化的进一步研究提供了基于线粒体基因组的新框架。
石蝇（Insecta: Plecoptera）是最古老的具翅昆虫谱系之一，其化石记录可追溯至二叠纪，全球分布以低温、富氧的流水环境为中心。Leuctridae Klapálek, 1905科俗称卷翅石蝇或针翅石蝇，隶属Nemouroidea总科，是该总科目前公认的五个科（Leuctridae、Capniidae、Nemouridae、Notonemouridae和Taeniopterygidae）之一。该科约400个已描述种分布于12属，是Nemouroidea中物种最丰富的科之一。该科基本呈全北区分布，主要多样性中心位于东亚山地、欧洲阿尔卑斯山系和北美东部，而若干leuctrine属（如Rhopalopsole和Perlomyia）向南延伸至亚热带和热带东南亚。幼虫为源头溪流中腐叶的碎食者（shredders），许多短翅（brachypterous）或无翅（apterous）成虫飞行能力减弱而限制了扩散；这种与小而孤立的冷水生境的紧密关联使该科对环境变化高度敏感，在淡水生物评价与保护中具有重要价值。传统形态分类将Leuctridae分为两个亚科，即Leuctrinae和单属的Megaleuctrinae（Megaleuctra），但这一长期分类最近受到分子系统发育证据的挑战。形态性状的多种内在局限阻碍了Leuctridae内部的系统学解析：广泛存在的翅退化同塑性（homoplasy）及在独立谱系中反复发生的翅丢失限制了翅脉和端部特征在属级界定与系统发育推断中的效用。在种级水平，种内与种间形态变异的重叠及隐存种形成（cryptic speciation）进一步模糊了种界，使分子数据成为准确定量和进化分析不可或缺的手段。最为关键的是，分子数据集已对Leuctridae的单系性提出挑战：一项多位点Sanger系统发育将Megaleuctra恢复为Capniidae的姐妹群而非其他leuctrid属的姐妹群，这与Illies基于雄性生殖器的假说一致；而转录组数据将Megaleuctra置于所有其余leuctrids的姐妹谱系；形态学分析则支持Megaleuctrinae为所有其他Leuctridae的姐妹群。这些相互冲突的结果对经典亚科框架的有效性提出了根本性质疑。迄今为止，鲜有分子数据集被专门用于解决Leuctridae的科内系统发育关系，完整线粒体基因组在澄清这些争议性进化关系方面的效力仍待探索。Leuctridae的高级阶元系统发育位置也仍缺乏解析，以往分子研究之间存在拓扑冲突。早期基于线粒体基因组的分析将Leuctridae置于Euholognatha或Nemouroidea最早分化谱系，但节点支持较弱。随后基于扩展分子取样的分析产生了相互冲突的拓扑：一项分化时间分析将Leuctridae置于Scopuridae + Taeniopterygidae分支的姐妹群；而最近一项在位点异质模型下的线粒体基因组系统发育将Scopuridae恢复为Euholognatha最早分化谱系，Taeniopterygidae为Leuctridae的姐妹群。转录组数据同样未能为euholognathan科级系统发育产生稳健解析的骨架。新出现的证据表明，Leuctridae中显著的线粒体组成异质性（compositional heterogeneity）可能在系统发育重建中引入系统性偏差，部分解释了这些普遍存在的拓扑不一致。此外，现有leuctrid分子数据集受取样局限严重，多数属和地理区域未被取样。迄今为止，尚无基于线粒体基因组且属级取样密集的评估全面验证两个传统亚科的单系性或澄清科内属级系统发育关系；Yang和Du最近的四属分析排除了Megaleuctra，使亚科单系性未经检验。除系统发育关系外，由于缺乏时间校准、密集尺度的分子系统发育，Leuctridae的进化与生物地理学历史仍缺乏刻画。分子分化时间估计提示Leuctridae冠群起源于劳亚大陆（Laurasian realm）约164 Ma（百万年前；95%最高后验密度[HPD]：133–193 Ma）的中侏罗世，而始新世波罗的海琥珀（Baltic amber）化石记录表明该科至始新世已多样化为多个属，包括现生和灭绝谱系。然而，关键进化问题依然存在，并可通过基于线粒体基因组的系统发育推断和分化时间估计加以解决。第一，驱动Leuctridae当前全北区和东洋区间断分布的时间框架与地质机制尚未在科级和属级得到检验；目级分析支持长距离扩散而非地理隔离，而地中海区域研究强调地理隔离驱动的格局。第二，物种丰富的东洋区Rhopalopsole谱系（东亚leuctrid多样性的核心组分）的时空起源与定殖过程缺乏稳健的分子校准。第三，间断分布的Megaleuctra的进化起源及其争议性系统发育亲缘关系需要基于充分线粒体基因组取样的严格验证。总之，这些知识空白严重限制了研究人员对Leuctridae多样化动态与进化历史的理解。在本研究中，研究人员组装了Leuctridae的全面线粒体基因组数据集，以重建稳健的科内系统发育关系。通过从近缘euholognathan科中精心选取外群用于树定根和化石校准的分化定年，研究人员旨在：(1) 解决关于Leuctridae单系性和内部属级分类的长期系统发育争议；(2) 基于线粒体证据探索Leuctridae在Euholognatha中的系统发育位置；(3) 阐明这一生态重要石蝇科的时序多样化格局与生物地理进化历史。本研究为理解Leuctridae的多样化与生物地理辐射提供了基于线粒体基因组的新进化框架。
在方法上，研究人员共纳入30个Leuctridae物种，代表该科目前公认12属中的9属，其中11种为新测序、12种为从GenBank检索的线粒体基因组、7种为下载的转录组原始数据以提取线粒体基因，另选近缘euholognathan科9种作为外群。新采集标本由Dávid Murányi依据成虫形态鉴定至种并保存于100%乙醇，凭证标本与提取DNA存放于中国河南省河南科技学院昆虫博物馆（HIST）。新取样品的总基因组DNA自胸部肌肉提取，经质量检测后用于Illumina TruSeq文库构建（平均插入片段约350 bp）并在Illumina NovaSeq 6000平台进行150 bp双端测序，每文库约产出10 Gb原始数据。线粒体基因组组装采用先前研究策略：原始reads经Trimmomatic v0.30过滤，clean reads用IDBA_UD v1.1.1进行从头组装（k-mer最小41、最大141）；22个转移RNA（tRNA）基因用MITOS网络服务器注释，蛋白编码基因（PCGs）和2个核糖体RNA（rRNA）基因通过与已发表leuctrid线粒体基因组同源序列比较鉴定并人工确定基因边界。七种下载的转录组原始数据以近缘种Leuctra fusca的13个线粒体PCGs和2个rRNAs为参考，用GeneMiner2在默认参数下组装对应线粒体基因，13个PCGs均恢复近全长并在遗传密码5下验证开放阅读框完整。系统发育分析使用30个leuctrid分类单元和9个外群线粒体基因组的13个PCGs和2个rRNA基因，Scopuridae为远外群，Taeniopterygidae、Capniidae、Nemouridae和Notonemouridae为近外群；各PCG在氨基酸水平用TranslatorX中的MAFFT算法比对，两个rRNA基因用MAFFT在线G-INS-I策略分别比对，模糊比对区用Gblocks屏蔽，比对结果在MEGA 7.0中拼接为两个数据集：PCGR（13个PCGs全部密码子位点加两个rRNA基因，拼接长度12,971核苷酸）和PCG12R（13个PCGs第一和第二密码子位点加两个rRNA基因，拼接长度9328核苷酸）。最佳分区方案和替换模型用ModelFinder依Akaike信息准则（AIC）选择；最大似然（ML）分析用IQ-TREE v1.6.1在edge-linked分区模型下进行，节点支持用1000次超快自举（ultrafast bootstrap）重复加SH-aLRT检验估计；贝叶斯推断（BI）用MrBayes 3.2.6在ModelFinder所选分区方案下进行，两次同时运行各1000万代、每1000代采样一次树、前25%样本作为burn-in舍弃，平均分裂频率标准差低于0.01视为收敛。组成异质性用两种互补χ2评估诊断：IQ-TREE报告的每分类单元组成χ2统计量（各序列对全体比对均值；df = 3）和基于分类单元×核苷酸列联表的全局碱基频率同质性χ2检验（df = 3[n ? 1]）；替换饱和用DAMBE中的Xia指数评估；碱基频率结构进一步通过各分类单元标准化A、C、G频率的主成分分析（PCA）可视化（省略T以避免组成闭合），得分在三个保留频率z-score标准化后获得。分化时间用PAML v4.10.10中实现的MCMCTree程序估计，以PCGR数据集的贝叶斯共识树为固定拓扑，节点年龄用五个化石校准点校准：根节点（Euholognatha冠群）以316.9 Ma软最大年龄约束，依据茎部plecopteran ?Gulou carpenteri的Westphalian B–C产出层位；Nemouridae + Notonemouridae冠群和Taeniopterygidae谱系分别基于?Paranotonemoura zwicki和?Jurataenionema以165.3 Ma最小年龄和316.9 Ma软最大年龄校准；始新世波罗的海琥珀化石?Megaleuctra neavei和?Leuctra spp.（Priabonian，37.71–33.9 Ma）分别用于校准Megaleuctra和Leuctra，这两个节点采用33.9–37.71 Ma的联合最小–最大界限（MCMCTree记法B(0.339, 0.3771)），即该区间上的均匀先验并带软界限（每侧2.5%尾概率），较年轻界限（33.9 Ma）视为冠群最小年龄，较老界限（37.71 Ma）为源自独立约束的Priabonian波罗的海琥珀地层年龄而非化石系统发育位置的生物学推断。分化时间用近似似然法估计，序列似然由baseml估计的梯度和Hessian矩阵计算，所有校准点以2.5%尾概率的软界限实现；采用相关速率时钟模型（clock = 3）、GTR替换模型（model = 7）且无位点间速率变异（alpha = 0）、cleandata = 0；出生–死亡–取样先验设为BDparas = 1 1 0 M；Gamma-Dirichlet先验设为rgene_gamma = 2 10 1、sigma2_gamma = 1 10 1、kappa_gamma = 6 2；三条独立MCMC链从不同种子运行，每条5,200,000代，舍弃前200,000代作为burn-in、每50代采样一次，每条链产出100,000后验样本；通过比较三条独立链的一致性检查稳健性，所有参数有效样本量（ESS）≥ 200。为评估年龄估计对校准方案的依赖性，在相同模型、先验和MCMC设置下另做两项分析：(i) 关闭序列似然的仅先验运行，从时间与替换速率的联合先验采样；(ii) 校准敏感性分析，移除两个波罗的海琥珀校准（Megaleuctra冠群和Leuctra冠群）后重复分析。祖先分布区重建中，研究人员依据30个取样Leuctridae物种的分布（来自GBIF国家级记录和Plecoptera Species File州/省级分布，辅以原始描述中的模式产地）划定六个离散区域：(A) 北美西部（WNA）；(B) 东洋区，即秦岭–淮河线以南的中国南方、台湾和东南亚大陆（SWC）；(C) 西古北区，即欧洲和安纳托利亚（EUR）；(D) 东古北区，即乌拉尔山以东的俄罗斯、日本列岛、朝鲜半岛和中国东北（NEA）；(E) 中亚–东亚过渡带，即蒙古和秦岭–淮河线以北的中国北方/中部，包括内蒙古、宁夏、陕西和新疆–青海–甘肃（CEN）；(F) 北美东部（ENA）。由于北美取样物种分布无干净经线分隔（东部种如Zealeuctra claasseni延伸至大平原，西部Megaleuctra stigmata达马尼托巴），WNA与ENA沿落基山东麓（约103 °W）划定，该界线使广布（多区）物种数最少；中国沿秦岭–淮河线细分，俄罗斯沿乌拉尔山（60 °E）细分；记录于一个以上区域的物种编码为广布（如Rhopalopsole subnigra：日本和台湾 = NEA + SWC；Paraleuctra zapekinae：NEA + CEN；Perlomyia smithae：CEN + NEA）。祖先分布区用R包BioGeoBEARS在去除外群的MCMCTree共识树上重建，六个离散区域编码为二元存在–缺失矩阵，允许广布（多区）分布；比较六种模型：扩散–灭绝–分支发生模型（DEC）、扩散–隔离分析模型（DIVALIKE）和BAYAREALIKE模型，各含与不含奠基者事件物种形成参数（+J）；鉴于多数plecopteran物种扩散能力有限，参照Letsch等将祖先分布区最大区域数约束为四；模型拟合用二阶Akaike信息准则（AICc）和相对AICc权重比较，最佳拟合模型下的祖先分布区在时间树上可视化；为评估结论对区域划定的敏感性，将CEN并入NEA的五区方案重复整个流程。
结果方面，3.1 系统发育分析：Leuctridae的系统发育关系由两个核苷酸数据集（PCGR和PCG12R）在BI和ML方法下推断，所得拓扑在所有属级及更深节点完全一致。Leuctridae被恢复为单系且支持强烈，所有30个取样种形成得到良好支持的分支而排除9个外群分类单元（两种BI分析中后验概率[PP] = 1.00；两种ML分析中SH-aLRT = 100、超快自举支持[UFBoot2] = 100）。在科间水平，四项分析均恢复Nemouroidea内一个近外群组合，其中Nemouridae与Notonemouridae聚在一起，随后依次为Capniidae、Taeniopterygidae和Leuctridae（PP = 0.957–1.00；SH-aLRT = 17.8–100/UFBoot2 = 50–100）。远缘外群Scopuridae被恢复为其余nemouroidean科的姐妹群。鉴于这些骨架节点的ML支持较低以及Leuctridae已记录的显著线粒体组成异质性，线粒体基因组数据对Nemouroidea内科间关系的解析有限，这与以往研究中Leuctridae位置的冲突一致。对两个数据集评估了组成异质性和饱和：每分类单元IQ-TREE χ2检验（df = 3）在39个PCGR分类单元中的27个拒绝组成同质性，而PCG12R分类单元中仅3个，且主要位于Leuctridae内；全局39 × 4列联表χ2检验（df = 114）在PCGR中高度显著（χ2 = 924.55，p < 0.0001，Cramér's V = 0.025）而在PCG12R中不显著（χ2 = 112.79，p = 0.51，V = 0.010），对PCGR第三密码子位点的分区限制检验更强（χ2 = 2298.57，p < 0.0001，V = 0.074），将信号定位至第三位点；每分类单元频率的PCA沿PC1（91.9%方差；AT丰富度梯度）分离两种编码方案，PCGR更分散；Xia熵基饱和指数在两矩阵中均远低于临界值（PCGR：Iss = 0.288–0.294 vs. Iss.c = 0.819–0.859；PCG12R：Iss = 0.157–0.165 vs. Iss.c = 0.816–0.856；均p < 0.001），PCGR中转换平台仅在约17%分歧度之后出现。由于偏差是谱系方向性的且定位于第三位点，位点异质CAT公式主要处理跨位点谱混合而非谱系组成非平稳性，因此去除第三位点的PCG12R对比提供了更直接的编码策略敏感性检验，跨矩阵拓扑一致性表明有偏位点不扭曲科内推断。在Leuctridae内，PCGR的BI和ML拓扑相同且其BI树在绝大多数节点支持强烈，而PCG12R BI树在若干浅节点支持较低，与去除第三密码子位点后损失系统发育信息位点一致；在ML分析中，两个数据集在一些浅的种内节点和科间骨架上支持较低。鉴于这些浅分歧处无替换饱和，PCGR的强支持最可能反映真实系统发育信号而非组成假象。这些诊断定量记录了上述组成异质性，并连同PCG12R提供的编码策略比较，定位而非推翻主要PCGR推断。在Leuctridae内，Megaleuctra（单属亚科Megaleuctrinae的唯一属）在四项分析中均被恢复为所有其余leuctrid属的姐妹谱系（PP = 1.00；SH-aLRT = 96.4–98.6/UFBoot2 = 80–93），支持该科的单系性及Megaleuctra作为其最早分化谱系的位置；这一位置证实了转录组和形态学证据，但拒绝了多位点Sanger数据推断的Megaleuctra–Capniidae姐妹关系。其余leuctrids（对应Leuctrinae）分为两个支持强烈的分支（PP = 1.00；SH-aLRT = 95.5–98.9/UFBoot2 = 94–98）：分支I中Despaxia与Leuctra聚在一起，该对又为Moselia的姐妹群；分支II由Paraleuctra和Pomoleuctra作为Perlomyia、Rhopalopsole和Zealeuctra的姐妹群组成。在分支I内，Despaxia为Leuctra的姐妹群（PP = 1.00；SH-aLRT = 99.9–100/UFBoot2 = 100）；Leuctra为单系并细分为两个种组，一组含L. duplicata和L. sibleyi，另一组含L. dalmoni、L. fusca、L. nigra、L. hippopus和L. hirsuta，尽管后者的内部关系在PCG12R数据集中解析较差（PP = 0.837–0.846；SH-aLRT = 45.7–54.6/UFBoot2 = 57–60）。在分支II中，Paraleuctra为单系且为Pomoleuctra的姐妹群（PP = 1.00；SH-aLRT = 100/UFBoot2 = 100）；Perlomyia为单系，P. collaris为其余四种的姐妹群；Rhopalopsole为单系（PP = 1.00；SH-aLRT = 100/UFBoot2 = 100），含两个谱系：一个包括R. bulbifera、R. flata、R. subnigra、R. triangulis和R. spiniplatta，另一个包括R. emeishan、R. horvati和R. prominens。值得注意的是，新北区Zealeuctra在四项分析中均被恢复为物种丰富的东洋区Rhopalopsole的姐妹谱系（PP = 1.00；SH-aLRT = 100/UFBoot2 = 100）。PCGR分析的节点支持总体高于PCG12R，四项分析在浅节点显示轻微不一致；然而两个数据集在所有属级及更深节点恢复相同拓扑，表明尽管leuctrid线粒体基因组存在组成异质性，纳入第三密码子位点未明显改变这些关系。3.2 分化时间估计：三条链后验中位数的两两比较显示高度一致（Pearson r ≥ 0.99999；归一化均方根偏差[RMSD] ≤ 8.4 × 10?3；最大绝对差 = 0.015 MCMCtree时间单位，即1.5 Ma），散点紧密聚集于恒等线附近，表明三条链产生一致的后验估计，支持收敛至同一后验分布，因此采用第1次运行的结果作为代表性估计。MCMCTree分析估计Euholognatha冠群年龄为229.8 Ma（95% HPD：198.4–266.1 Ma），Leuctridae与其姐妹群的分歧（节点n42，Leuctridae及其姐妹群的共同祖先）为223.9 Ma（95% HPD：195.06–256.98 Ma）；Leuctridae冠群年龄估计为205.9 Ma（95% HPD：178.1–237.0 Ma），中位数在晚三叠世，HPD跨越中/晚三叠世界线至早侏罗世。Taeniopterygidae和Nemouridae + Notonemouridae具侏罗纪中位数，而Nemouridae（115.6 Ma）和Capniidae（111.3 Ma）具白垩纪中位数，尽管HPD宽且跨越界线。在Leuctridae内，属冠群中位年龄从晚白垩世至晚始新世：Perlomyia 86.3 Ma（55.4–118.2 Ma）、Rhopalopsole 68.0 Ma（42.1–95.4 Ma）、Paraleuctra 65.9 Ma（39.1–95.7 Ma）、Leuctra 36.5 Ma（34.4–37.9 Ma）和Megaleuctra 36.1 Ma（34.0–37.8 Ma），后两者受波罗的海琥珀校准紧密约束；这两项估计对化石设置的依赖性经明确检验：在仅先验分析中，这些节点的边缘先验与主分析后验估计密切匹配（Leuctra：35.99 Ma，95% HPD 33.96–37.75 Ma；Megaleuctra：35.81 Ma，33.92–37.72 Ma），表明其狭窄HPD直接反映波罗的海琥珀区间（33.9–37.71 Ma）的紧密界限且这两个年龄本质上由先验决定，而其余节点先验均值接近主分析后验估计，表明主要受序列数据信息驱动；当移除两个波罗的海琥珀校准时，Leuctra和Megaleuctra冠群年龄分别大幅移至112.1 Ma（95% HPD：88.37–137.49 Ma）和175.67 Ma（95% HPD：139.63–213.83 Ma），其他科内节点年龄相应改变，而科级节点仅受轻微影响，表明Leuctridae的科内分化时间主要由波罗的海琥珀化石记录驱动，而更深科间时间框架对校准方案稳健。这些估计与近期该科及其近缘类群的分子时间估计大体相容。3.3 祖先分布区估计：在六区方案下，DIVALIKE + J模型拟合最佳（lnL = ?51.22，AICc = 109.36），获72.3%的AICc权重，其次为DEC + J（11.4%）和无约束DIVALIKE模型（8.3%）；奠基者事件物种形成参数j在所有+J模型中估计大于零（DIVALIKE + J下j = 0.029），AICc比较提供奠基者事件物种形成的主要支持，而灭绝率e在每个模型中收敛于下界，表明在此分类尺度上灭绝实际不可识别；模型排序不受区域划定影响：在CEN并入NEA的五区方案下，DIVALIKE + J再次居首（lnL = ?39.40，AICc = 85.73，AICc权重77.5%，j = 0.042），其次为DEC + J（20.6%）。因此祖先分布区在DIVALIKE + J模型下解释。在六区方案下，Leuctridae冠群节点（205.9 Ma，95% HPD 178.1–237.0 Ma）最可能的祖先分布区为北美西部（WNA；相对概率0.59），并有对WNA + ENA（北美东部）分布的相当额外支持（ENA边缘概率0.40）；约152至65 Ma间该科多数深部内部节点恢复为WNA主导分布（相对概率0.50–0.97），与北美西部早期多样化一致，尽管替代的WNA + ENA分布获得相当支持且重建依赖模型；例外为Rhopalopsole + Zealeuctra和Rhopalopsole的冠群节点。东洋区Rhopalopsole与新北区Zealeuctra联合分支的冠群节点（90.2 Ma，95% HPD 59.5–122.8 Ma）解析较差：单一最可能分布为北美东部（相对概率0.37），而东亚分布累积更高边缘概率（SWC 0.59），因此该跨太平洋谱系的北美或东亚起源在现有数据下无法区分；在替代DEC + J模型下，科冠群节点最可能分布为WNA + ENA而非仅WNA，故两个最佳评分奠基者事件模型的选择影响该节点重建。在较浅系统发育深度，Rhopalopsole冠群节点（68.0 Ma，95% HPD 42.1–95.4 Ma）以高置信度重建为SWC（相对概率0.93），该属内所有后续节点均留在中国西南，与持续的原位辐射一致；Perlomyia分支呈相反格局：其冠群节点（86.3 Ma）最可能为WNA（0.61），而P. isobeae、P. kappa、P. levanidovae和P. smithae所在节点（46.7 Ma）稳固为东北亚/NEA（0.998），暗示从北美定殖西北太平洋沿岸；Paraleuctra冠群节点（65.9 Ma）最可能为WNA（0.50），NEA和NEA + CEN分布亦受支持，其37.1 Ma节点重建为NEA（0.94）；在Leuctra内，冠群节点（36.5 Ma）最可能为欧洲（EUR；0.36），五个西古北区种所在节点（28.5 Ma）近乎确定地重建为EUR，而新北区L. duplicata + L. sibleyi对（24.7 Ma）明确为ENA；Megaleuctra冠群节点（36.1 Ma）重建为ENA + WNA（0.62），反映该属北美东部与西部种组间现今的间断。五区敏感性分析（CEN并入NEA）未实质改变任何这些结论：模型排序不变，Leuctridae冠群节点仍为WNA（相对概率0.52），所有属级归属保留；唯一明显变化涉及Paraleuctra，其冠群节点从六区方案的WNA（0.50）移至五区方案的NEA（0.59），这是将P. cuihuashana的CEN分布并入NEA的预期结果。总之，重建对生物地理区域划定稳健；两个奠基者事件模型的选择同样影响有限：在每个区域方案内逐节点比较两模型，DEC + J和DIVALIKE + J在六区和五区方案的29个内部节点中的27个恢复相同最可能祖先分布，同样两个例外为科冠群节点（两模型均支持涉及WNA的分布，WNA边缘概率0.95–0.98）和支持较弱的Leuctra冠群节点（DIVALIKE + J下为EUR，DEC + J下为ENA；所有相对概率< 0.5）。
讨论部分，研究人员分析提供了Leuctridae科首个科级时间校准的生物地理重建，并提示该科历史远比先前估计古老；科冠群年龄约206 Ma将起源置于晚三叠世，在宽可信区间内与近期整个襀翅目的分子时间尺度及该目推断的多样化动态大体相容。Leuctridae随后出现于始新世波罗的海琥珀，表明该科主要谱系在始新世–渐新世界线古北区变冷之前已建立。如今该科在温带北半球尤其东亚和北美多样性最高，重建提示这一格局由深时分布区持续、反复长距离定殖及可能的古老地理隔离组装而成。在较高级分类水平，分析以最大支持确认Leuctridae单系（PP = 1.00；SH-aLRT = 100/UFBoot2 = 100），与以往转录组和形态学处理一致，同时将Megaleuctra–Capniidae关系的多位点Sanger假说冲突解决为支持按传统界定该科的单系性。然而Leuctridae在Nemouroidea内的位置仍是石蝇系统发育中最持久的不确定性之一：尽管四项分析恢复相同骨架（Nemouridae与Notonemouridae聚在一起，随后依次为Capniidae、Taeniopterygidae和Leuctridae），但这些深节点的ML支持较低（SH-aLRT = 17.8–100/UFBoot2 = 50–100），且leuctrid线粒体基因组的显著组成异质性告诫不要过度解释此拓扑；该困难并非本研究数据独有，以往线粒体基因组和多位点研究将Leuctridae置于总科内相互冲突的位置，甚至最近基于线粒体基因组的分析也不一致，将Leuctridae恢复为联合Capniidae、Taeniopterygidae、Nemouridae和Scopuridae的分支的姐妹群或处于其他互不相容的位置；解决此骨架可能需要Nemouroidea内更密集的分类单元取样并结合不易受线粒体组成偏差影响的标记，如转录组或锚定杂交富集（anchored hybrid enrichment）。在Leuctridae内，Megaleuctra被恢复为所有其余属的姐妹谱系（PP = 1.00；SH-aLRT = 96.4–98.6/UFBoot2 = 80–93），使线粒体基因组结果与Zwick经典形态系统（单属Megaleuctrinae被视为该科最早分化分支）及北美襀翅目转录组系统发育协调，同时拒绝多位点Sanger数据推断的Megaleuctra–Capniidae姐妹关系。其余属（对应Leuctrinae）分为两个支持强烈的主要分支：分支I联合Despaxia和Leuctra与Moselia，分支II联合Paraleuctra和Pomoleuctra与Perlomyia、Rhopalopsole和Zealeuctra；该框架通过明确属间关系细化了Zwick基于形态的属分组，并与该科新兴分子图景大体一致。特别是分支II内Rhopalopsole与Perlomyia的紧密关联呼应了Shimizu对日本Leuctridae分类学再评估中这些主要东洋区属的分组及Yang和Du基于线粒体基因组的假说，尽管后者仅限四个中国属且将Leuctra置于(Rhopalopsole + Perlomyia) + Paraleuctra的姐妹群，这一位置与本研究分支I和II间深分裂冲突；需更密集取样以调和此差异。全北区Paraleuctra与新北区Pomoleuctra间以最大支持恢复的姐妹关系进一步提示分支II的属级多样化先于全北区动物区系生物地理分化，尽管此推断基于单一姐妹群配对。在属级，两项结果直接关系到下文发展的生物地理解释：新北区Zealeuctra被恢复为物种丰富东洋区Rhopalopsole的姐妹谱系（PP = 1.00；SH-aLRT = 100/UFBoot2 = 100），为定年分析置于约90 Ma的东亚与北美间古老跨太平洋联系提供独立系统发育佐证；在Leuctra内，新北区种组（L. duplicata和L. sibleyi）与西古北区种组（L. dalmoni、L. fusca、L. nigra、L. hippopus和L. hirsuta）的清晰分离与该属旧世界–新世界深分化一致，而后一组内解析较差呼应欧洲L. inermis种组和南阿巴拉契亚北美东部Leuctra区系整合研究揭示的显著隐存多样性和近期多样化；此类格局提示Leuctra及可能其他leuctrid属的种级关系将需要更密集取样和进化更快的标记。最后，PCGR和PCG12R数据集在所有属级及更深节点恢复相同拓扑且PCGR分析节点支持总体更高，表明纳入第三密码子位点未明显改变这些关系；然而两个数据集仍受相同线粒体组成偏差影响，需氨基酸或简并密码子比对分析以正式排除系统误差。北美西部作为Leuctridae冠群及多数深部节点最可能祖先分布区的恢复（本分析倾向而非牢固确立的假说）鉴于该科旧世界多样性而值得注意；现生谱系起源于北美西部与北美襀翅目系统发育基因组分析恢复的强新北区印记一致，尽管与Hynes关于北美石蝇区系主要通过从欧亚及其他源区反复迁入组装而成的经典观点相反。北美西部兼具高地形复杂性和贯穿新生代大部分时期的湿润温带生境，这些条件可能既作为多样化摇篮又作为气候恶化期间的避难所。Megaleuctra冠群重建为ENA + WNA分布（该属现今间断分布于北美和朝鲜半岛）进一步说明该大陆内部生物交换的作用。更广泛地，结果契合水生昆虫时间校准“生命之树”分析的新兴图景，其中全北区分支常保留北美或白令陆桥枢纽信号，这与冈瓦纳地理隔离主导分布的南温带动物区系相反。东洋区Rhopalopsole与新北区Zealeuctra约90 Ma重建的姐妹关系为襀翅目中东亚与北美间有充分记录的间断分布增添显著案例；其他石蝇谱系已知类似跨白令和跨太平洋间断，俄罗斯远东反复被确定为该目的生物地理十字路口和冰期避难所；绿襀科Alaskaperla的洲际间断和远东石蝇区系的动物地理结构均指向同一走廊，估计提示该走廊自晚白垩世起可能对leuctrid谱系可用；由于Rhopalopsole–Zealeuctra祖先的祖先分布区解析较差，研究人员将跨白令路线视为一个可能的历史情景而非本分析的直接推断。同时，所有68 Ma以年轻的Rhopalopsole节点强烈限于SWC的重建表明，一旦建立，谱系可能数百万年保持区域特有；石蝇扩散能力弱，比较证据表明尤其减翅类群追踪过去连接而非当前扩散路线；因此检测到的奠基者事件信号（所有最佳模型中j > 0）与跨障碍的罕见偶然扩散事件一致，这是扩散能力有限昆虫预期的分布区扩张模式，尽管研究人员将此视为基于模型的推断而非历史过程的直接证据。在方法学上，结果为奠基者事件物种形成改善概率生物地理学模型拟合的日益增多证据增添内容，同时也说明此类结果为何需谨慎：DEC + J模型因概念和统计理由受到批评，DEC与DEC + J间基于似然的比较可能误导；在本研究数据中灭绝参数在所有模型中被推至下界，这是端元年龄均一且分布区动态由分支发生主导时的常见假象，DIVALIKE + J优于DEC + J的相对支持虽明确但基于单一科30个取样种；因此模型选择仅确立DIVALIKE + J在所评估模型中的相对拟合，本身不能证明奠基者事件物种形成是实际历史机制，结果的更广泛推广受分类单元取样限制；据此研究人员定性解释重建，将正奠基者事件参数视为最佳拟合模型的属性而非直接生物学证据，并强调跨区域划定的稳健性而非精确参数估计。本分析若干局限值得考虑：取样覆盖约400个有效Leuctridae种中的30个及目前公认12属中的9属，未取样属Calileuctra（2种）、Pachyleuctra（3种）和Tyrrhenoleuctra（6种）、东洋区动物区系（Rhopalopsole可能的多样性中心）及Megaleuctra的东亚（韩国）谱系代表主要分类和地理空白；未取样谱系可能改变深部节点重建，完全依赖线粒体标记亦然；以整个大陆为尺度的区域编码必然掩盖区域内结构，合并的五区分析虽令人安心但不能排除所有区域划定假象；重要的是，对区域划定的稳健性并不意味着对不完整分类单元取样的稳健性：所提出的北美起源是在该科东亚多样性可观的情况下推断的，东洋区动物区系更密集取样可能移动深部节点重建。未来进展需要更密集分类单元取样尤其跨东亚和东洋区、整合形态证据（包括具分类信息的卵和雌性生殖器特征）与分子数据、基因组尺度标记以解析该科浅骨架、以及明确古地理模型（包括扩散率随时间与路径变化的时间分层分析）以进一步检验这些情景；此类数据将使检验此处推断的北美西部枢纽反映真实进化起源还是古老更广全北区分布的残留信号成为可能。
结论部分译为：本研究基于代表目前公认12属中9属的30个物种的线粒体序列数据，提供了Leuctridae科首个科级时间校准的生物地理综合。线粒体数据确认该科单系并解析Megaleuctra为其最早分化谱系，随后其余leuctrids分为两个主要Leuctrinae分支，尽管Nemouroidea内关系仍解析较弱且线粒体分析对组成异质性敏感。定年分析将科起源置于晚三叠世，DIVALIKE + J模型下祖先分布区重建支持北美西部为最可能起源区（此假说需更密集分类单元取样检验），东亚与北美间现存间断分布由深时分布区持续和反复长距离定殖产生，并可能结合古老地理隔离。重建对区域划定稳健但对不完整分类单元取样不稳健，且在奠基者事件物种形成的识别上依赖模型，因此研究人员强调其定性解释。鉴于约400个有效种且东洋区动物区系仍 largely 未取样，此处呈现的系统发育和时间尺度为未来整合更密集分类单元取样、基因组尺度标记和明确古地理模型以进一步解析该科进化历史的研究提供了框架。
