波多黎各草地贪夜蛾田间进化对多杀菌素类杀虫剂的抗性：对伏蚁腙类抗性治理的启示

《Insects》：Field-Evolved Resistance to Spinosyns in Fall Armyworm Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) from Puerto Rico: Consequences for Resistance Management

　　

研究人员在波多黎各种子玉米产区采集的草地贪夜蛾（FAW，Spodoptera frugiperda）田间种群（PPR）中鉴定出对多杀菌素类（spinosyns，包括多杀菌素spinosad和乙基多杀菌素spinetoram）的田间进化抗性。采用增效剂试验的结果提示，解毒酶类参与杀虫剂代谢。抗性品系与敏感品系之间的遗传杂交显示不完全显性，这可能允许杂合个体存活。为防止这些可能加速抗性发展的杂合个体存活，关键在于采用适宜的杀虫剂施用剂量、轮换使用杀虫剂并实施有害生物综合治理（IPM）。本研究评估了波多黎各抗多杀菌素和乙基多杀菌素的PPR品系与敏感品系（SUS）相比的抗性机制。采用饲料覆盖生物测定法，PPR表现出高水平抗性，多杀菌素RR₅₀值为214倍，乙基多杀菌素为63.3倍。使用胡椒基丁醚（PBO）、S,S,S-三丁基三硫代磷酸酯（DEF）、马来酸二乙酯（DEM）和盐酸维拉帕米（VER）进行的增效剂试验在不同程度上提高了对杀虫剂的敏感性，提供了多种解毒和转运过程可能参与抗性的间接证据。对于多杀菌素，DEM和DEF的增效作用最强，而DEM和维拉帕米对乙基多杀菌素产生最强效应。这些反应与谷胱甘肽S-转移酶、酯酶、ATP结合盒转运蛋白（ABC transporters）和细胞色素P450的可能参与相一致；然而，其具体作用需通过生化与分子分析加以确认。遗传学研究表明，显性程度具有浓度依赖性，并通常随杀虫剂浓度升高而下降。抗性在较低浓度下倾向于更为显性，而在所测试的最高浓度下反应近似加性，尽管乙基多杀菌素的正反交之间模式存在差异。这些发现表明，暴露于低或中等浓度可能有利于杂合个体的存活，并可能促进抗性等位基因的扩散。总体而言，这些发现支持通过适宜施用剂量和轮换使用不同作用机制杀虫剂进行综合抗性治理，同时鉴定了值得进一步研究的生理过程。

**研究背景与意义**

草地贪夜蛾（fall armyworm，FAW，Spodoptera frugiperda）是全球玉米生产的重要威胁，其危害表现为严重 defoliation 和杀虫剂抗性的快速进化。该害虫原产于美洲，已扩散至非洲、亚洲、澳大利亚和欧洲，加之其广泛的寄主范围和快速的环境适应能力，使得创新性害虫治理策略的开发尤为迫切。截至目前，FAW对45种不同活性成分已记录250例抗性事件，成为全球性重大关注对象。FAW对食用和饲用玉米造成的直接损失可达近60%的减产，但其对全球种子玉米产业的影响较少被认识。波多黎各作为玉米种子繁育与生产的关键枢纽，拥有熟练劳动力、热带气候、优质土壤、靠近美国本土、高效运输和健全的知识产权法等优势，吸引了拜耳、科迪华和先正达等主要农业公司。据波多黎各农业生物技术产业协会统计，全球生物技术农业所用种子中超过85%在波多黎各的某一开发阶段完成。波多黎各适宜种子玉米的气候同样利于FAW，使其每年可发生多达10代、玉米每年种植4季（即寄主作物持续存在）。若不加控制，FAW可造成作物完全损失。这种高虫压迫使种子玉米田采取广泛的害虫治理措施，但种子生产中对幼虫危害的治理需要大量农药施用，每季多达30次、涉及至少9种不同作用机制，导致当地FAW种群进化出农药抗性。该抗性涵盖多种合成杀虫剂以及转基因（GM）玉米中的苏云金芽孢杆菌（Bt）蛋白，进一步加剧了治理难度并威胁种子生产的可持续性。

多杀菌素类来源于土壤中分离的Saccharopolyspora spinosa的好氧发酵，是一类具有突破意义的大环内酯类杀虫剂。多杀菌素和乙基多杀菌素是该类群中最著名的成员，2018年销售额接近6亿美元。其受欢迎部分归因于生态友好特性，对非靶标物种和生态系统影响极小。多杀菌素类具有独特的作用机制（IRAC第5组），靶向昆虫烟碱型乙酰胆碱受体和GABA门控离子通道，诱导快速神经系统兴奋、不自主肌肉收缩、震颤、麻痹并最终死亡。这些特性使多杀菌素类在害虫已对较老作用机制杀虫剂产生抗性的种植体系中具有重要价值。在波多黎各，首个多杀菌素基产品Tracer于2008年8月登记，初期对FAW表现出优异防效。但激进的营销活动导致许多农场囤积产品，四年内其效力下降至初始水平的一半以下。第二个多杀菌素基产品Entrust于2013年9月引入，得益于对早期过度使用的教训以及IRAC-US和种子公司的协调建议，其防效得以保持至2021年首次检测到抗性迹象。多杀菌素抗性此前已在巴西和中国FAW种群中记录，乙基多杀菌素抗性也在其他种群中有报道。确保多杀菌素类的长期、安全、有效使用对其作为种子玉米生产IPM项目工具的持续成功至关重要。除多杀菌素类外，本研究还考虑了其他杀虫剂以更好地理解FAW的潜在抗性模式，包括阿维菌素、甲氧虫酰肼和氟酰脲。本研究旨在表征波多黎各种子生产区FAW种群对多杀菌素和乙基多杀菌素的抗性，采用正反交和浓度-反应生物测定评估抗性遗传和浓度依赖性显性，开展增效生物测定探究解毒和转运过程的潜在参与，并用其他类别杀虫剂评估抗性模式。理解这些抗性特征对于制定种子玉米生产体系的有效抗性治理策略和维持多杀菌素类在IPM项目中的可持续性至关重要。

**关键技术方法**

研究人员从波多黎各庞塞（Ponce）使用多杀菌素和乙基多杀菌素防治FAW的玉米田采集约300头4—5龄幼虫，2019年运至密歇根州立大学建立种群（PPR）；敏感品系（SUS）获自拜耳美国研究设施。采用饲料覆盖生物测定法在24孔板中测试多杀菌素（Entrust? SC）和乙基多杀菌素（Delegate? WG）的浓度-反应，每浓度48—60头幼虫，4天后评估死亡率。通过正反交（H1：♂SUS×♀PPR；H2：♀SUS×♂PPR）评估抗性遗传。增效生物测定采用饲料覆盖和点滴两种途径，测试PBO、DEF、DEM和VER的增效作用。另用阿维菌素、氟酰脲和甲氧虫酰肼进行敏感性生物测定。数据分析采用概率分析（PROBIT）、Stone法和DM公式计算显性度。

**研究结果**

**3.1 多杀菌素类的浓度-反应生物测定**：PPR种群对多杀菌素表现出极高水平抗性，RR₅₀为213.7倍、RR₉₀为2140倍；对乙基多杀菌素抗性较低，RR₅₀为63.3倍、RR₉₀为111倍。多杀菌素H1和H2的LC₅₀值95%置信区间重叠，提示抗性为常染色体遗传；乙基多杀菌素H1和H2的LC₅₀值95%置信区间不重叠，提示抗性遗传可能为X连锁并基于不同机制。

**3.2 显性度**：通过DM公式测定，两种杀虫剂在正反交中呈现一致趋势。多杀菌素H1（0.85）和H2（0.7）的最高DM值出现在最低测试浓度0.002 μg/cm²，随后随浓度升高而下降，在最高浓度10 μg/cm²时趋近于零，表明抗性在低浓度下主要显性、随浓度升高而趋于隐性。乙基多杀菌素H1 progeny呈现类似浓度依赖性下降，H2 progeny呈倒U形曲线。总体而言，暴露于抗性部分显性的浓度可能有利于杂合个体存活并促进抗性等位基因扩散。

**3.3 增效剂生物测定**：多杀菌素对PPR的毒性在增效剂存在下增强，DEF的SR₅₀最高（155），其次为DEM（122）、VER（52）和PBO（4）；SUS的相应SR₅₀分别为1.5、3.6、2.9和7.3。PPR中PBO、DEM、DEF和VER联合应用SR₅₀为77.5，低于DEF和DEM单独应用，未产生加性或累积效应。点滴施用增效剂使PPR中多杀菌素毒性SR₅₀为41—51。乙基多杀菌素增效试验中，PPR的DEM（SR₅₀=15.8倍）和VER（11.9倍）毒性增强最高。

**3.4 PPR和SUS对阿维菌素、氟酰脲和甲氧虫酰肼的敏感性**：PPR对阿维菌素敏感性降低，RR₅₀为13.7但RR₉₀仅1.12，反映两品系浓度-死亡曲线斜率显著不同（4.8和1.2），高浓度下曲线收敛。PPR对甲氧虫酰肼RR₅₀和RR₉₀分别为62.5和216倍；对氟酰脲RR₅₀和RR₉₀仅1.6和2.0倍，表明两品系敏感性相似。

**讨论与结论**

PPR品系对两种多杀菌素杀虫剂均表现出高水平抗性，LC₅₀和LC₉₀水平的多杀菌素抗性比分别为213倍和2140倍，乙基多杀菌素分别为63倍和111倍，高于此前报道的庞塞FAW种群低于14倍的值。波多黎各种子玉米生产区及邻近作物历史上多杀菌素和其他杀虫剂的集约使用可能促进了抗性个体的选择。多杀菌素类抗性在全球多个昆虫物种和作物中已有记录。PPR对阿维菌素敏感性降低（RR₅₀=13.7，RR₉₀=1.12），但由于曲线斜率差异显著，这种敏感性差异依赖于死亡反应水平，不应解释为整个浓度范围内的均匀抗性。对甲氧虫酰肼高水平抗性与该杀虫剂田间防效下降相关；对氟酰脲无显著差异，表明波多黎各FAW种群不应被视为对所有昆虫生长调节剂普遍抗性或交叉抗性。近期分子研究表明巴西FAW乙基多杀菌素抗性主要与烟碱型乙酰胆碱受体靶标位点改变相关，但本研究未评估靶标突变或受体表达变化。增效反应提供了解毒和转运过程可能参与PPR多杀菌素抗性的间接证据，但敏感性未被一致恢复，不能排除其他机制，需生化与分子分析予以鉴定。多杀菌素抗性在多种鳞翅目昆虫中广泛存在，乙基多杀菌素抗性较少见可能因其价格远高于多杀菌素。多杀菌素抗性的常染色体不完全隐性遗传已在多种昆虫中报道。本研究中正反交F1相似反应表明多杀菌素抗性与常染色体、LC₅₀水平不完全隐性遗传模式一致，但有效显性随浓度变化，低浓度下显性度较高。乙基多杀菌素正反交F1浓度-死亡反应不同，H1不完全隐性而H2不完全显性，正反交不对称提示不能确认为严格常染色体遗传，虽可能与性连锁遗传一致，但母体效应、细胞质遗传、亲本遗传组成差异或实验变异不能排除，需进一步遗传实验区分。研究表明FAW多杀菌素抗性的有效显性具有浓度依赖性，杂合个体在低或中等浓度下存活概率高于最高浓度。田间条件下，因杀虫剂残留下降、喷雾覆盖不完整或低于标签剂量施用，可能发生亚致死暴露，有利于杂合个体存活和抗性等位基因持续。但实验室浓度未直接关联田间标签施用量，杂合个体存活未在田间评估，结果不应解释为特定田间施用量可阻止抗性发展的直接证据。按标签推荐施用多杀菌素类、确保充分喷雾覆盖和轮换不同作用机制杀虫剂仍是抗性治理项目的重要组成部分。多杀菌素类因其杀虫活性、对多种有益节肢动物的相对有利选择性和独特作用机制而成为综合抗性治理（IRM）策略的重要组分，其在常规和有机农业中的可用性可能无意中促进"实际抗性"的发展。本研究聚焦单一田间来源种群，未评估多杀菌素使用模式、基因流、迁移或波多黎各FAW种群遗传结构。种子玉米生产大部分集中于南部约1500—3000公顷区域，共享相似的农药施用和管理实践历史。需要对波多黎各不同农业区域FAW种群进行空间和时间结构化监测，以确定多杀菌素抗性的地理分布和时间稳定性；结合浓度-反应生物测定、种群遗传分析和记录的杀虫剂使用历史有助于确定局部选择、迁移和基因流对抗性分布的相对贡献。自1997年多杀菌素上市以来，其对鳞翅目害虫的防效受到密切监测，抗性成为重要关注。研究表明约三分之二的多杀菌素抗性通过靶标位点突变产生，其余涉及代谢抗性、涉及多基因和机制。烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）Dα6亚基与菱形蛾、果蝇和家蝇的抗性相关；特定受体跨膜点突变（如G275E）已在多种物种中鉴定。节肢动物农药抗性数据库（APRD）记录了约36个物种363例多杀菌素类抗性事件。FAW多杀菌素和乙基多杀菌素抗性自2017年以来在巴西、中国和波多黎各等多个国家观察到。尽管田间进化抗性相对罕见——以中国（2021和2022年）和波多黎各（2019年）的重大事件为标志——但其潜在机制常未被探索。PPR品系对两种多杀菌素类均表现高水平抗性。饲料覆盖增效生物测定中，DEM、DEF、VER和PBO的添加在不同程度上提高了PPR幼虫对多杀菌素的敏感性，DEM和DEF增效反应最强，其次为VER和PBO。这些增效反应提示受试化合物可改变多杀菌素敏感性，但未确定PPR品系抗性的具体解毒或转运机制。PPR和SUS之间增效比的差异应谨慎解释，因为增效剂效应可能受化合物特异性吸收、生物利用度和实验条件影响；不同暴露途径获得的增效比不能直接比较。观察到的反应应视为初步药理学证据，需进一步生化、分子和功能研究阐明多杀菌素抗性机制。先前功能研究为ABC转运蛋白可能参与FAW对多杀菌素反应提供了相关背景：CRISPR/Cas9介导的SfABCC2和SfABCC3敲除增加了实验室FAW品系对多杀菌素和阿维菌素的敏感性，表明这些转运蛋白可影响对小分子杀虫剂的反应。本研究中VER暴露后多杀菌素敏感性增加与ABC转运蛋白介导过程可能参与PPR抗性表型相一致，但VER对单个ABC转运蛋白不具特异性，增效生物测定未测量转运蛋白表达、活性或遗传变异，因此结果提供间接证据，未鉴定SfABCC2、SfABCC3或任何其他特定转运蛋白为抗性机制。ABC转运蛋白也与FAW对Bt蛋白的抗性相关，包括2007年建立的波多黎各实验室群体中Cry1F抗性，但ABC转运蛋白作为Bt Cry蛋白受体的作用在机制上不同于其对小分子杀虫剂（如多杀菌素）的潜在转运或解毒参与，Bt抗性证据不能直接外推至PPR品系的多杀菌素抗性。维拉帕米此前作为药理学抑制剂用于研究其他节肢动物中ABC转运蛋白对杀虫剂反应的潜在参与。需对PPR品系进行分子和生化分析以鉴定特定ABC转运蛋白、确定其功能作用并确立遗传或表达变化是否参与多杀菌素抗性。由于本研究未评估靶标位点突变，无法就其在PPR品系多杀菌素抗性中的存在或贡献得出结论。PBO、DEM、DEF和VER的增效反应提供了与多种解毒和转运过程潜在参与相一致的间接证据，但这些生物测定未直接测量酶或转运蛋白活性、表达或遗传变异，未证明四条不同或独立的抗性途径；增效剂处理后敏感性未完全恢复表明不能排除其他机制。需生化测定、基因表达分析、靶标位点测序和功能验证以确定PPR品系抗性机制。该种群观察到的抗性高水平强化了抗性监测和实施抗性治理实践的重要性，包括遵守标签施用量、充分喷雾覆盖和轮换不同作用机制杀虫剂。反复杀虫剂暴露、集约作物生产和有利于害虫持续活动的有利气候条件可增加农药抗性选择压力。多杀菌素田间进化或实际抗性已在其他害虫-生产体系中记录，包括夏威夷菱形蛾种群、美国长岛马铃薯生产登记后不久暴露的种群以及西班牙Almeria和Murcia集约温室生产相关的西花蓟马种群，这些例子说明反复暴露可在不同生产条件下促进多杀菌素抗性进化，但涉及不同害虫物种、地理环境、杀虫剂使用历史和管理体系，不应解释为波多黎各FAW多杀菌素抗性的直接类比。FAW向新地理区域扩张和对杀虫剂的持续依赖增加了敏感性监测和本地适应IRM项目的重要性。全年种子玉米生产和持续FAW压力创造了抗性治理尤为重要的条件，尽管本研究未直接量化气候、农药使用强度、迁移或地理隔离对抗性进化的贡献。IRAC-US和PRABIA此前支持了区域性抗性治理项目，聚焦田间试验、农药轮换、侦察、实施和监测以遏制多杀菌素抗性。PPR品系观察到的高抗性水平强化了这些活动的价值，并支持对波多黎各FAW种群多杀菌素敏感性进行持续的空间和时间监测。需进一步田间采集和记录的杀虫剂使用历史以确定抗性当前分布并评估抗性治理实践的有效性。总体而言，这些发现支持通过适宜施用剂量和轮换使用不同作用机制杀虫剂进行综合抗性治理，同时鉴定了值得进一步研究的生理过程。