恶性疟原虫RNA N6-甲基腺苷修饰的单核苷酸分辨率图谱及其与mRNA 3'末端加工和多聚腺苷酸化事件的关联分析

《RNA Biology》：Nucleotide-resolution mapping of RNA N6-methyladenosine (m6A) modifications and comprehensive analysis of global polyadenylation events in mRNA 3’ end processing in malaria pathogen Plasmodium falciparum

　　

N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物mRNA中最丰富的内部修饰，但其在疟原虫恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）中的分布及其在mRNA 3'末端加工中的潜在作用仍不清楚。本研究结合了单核苷酸分辨率的DART-seq、纳米孔直接RNA测序（Nanopore DRS）、MeRIP-seq以及互补的3'末端测序方法，研究了寄生虫转录组中m6A沉积与mRNA 3'末端形成之间的关系。DART-seq在1195个基因中鉴定出2330个可重复的m6A位点，揭示了表观转录组中存在阶段相关的差异，并且m6A优先富集于3'非翻译区（3' UTR）。独立的MeRIP-seq分析进一步支持了这些甲基化模式的可重复性。mRNA 3'末端定位显示，切割和多聚腺苷酸化频繁发生在异常富含腺苷酸的序列区域内。将纳米孔DRS衍生的m6A化学计量比与实验定义的多聚腺苷酸化位点（poly(A) sites）整合分析发现，m6A在典型的DRACH基序上优先富集，其位置大约位于转录本切割位点上游30–50个核苷酸处。值得注意的是，单分子DRS分析表明，在同一基因的近端和远端选择性多聚腺苷酸化（alternative polyadenylation, APA）亚型之间，共享转录本位置上的m6A占有率存在差异，其中远端亚型在近端切割位点附近的占有率较低。此外，在单个转录本中，m6A富集一致地出现在所使用的多聚腺苷酸化位点上游，这表明m6A沉积与选择性3'末端形成之间存在关联。研究还观察到RNA二级结构和m6A与多聚腺苷酸化位点区域存在不同的空间关联。总之，这些发现提供了恶性疟原虫中m6A修饰模式相对于天然多聚腺苷酸化位点的全转录组和单分子视图，数据与m6A与3'末端加工相关联并可能促进该过程的模型是一致的。

研究背景与科学问题

N6-甲基腺苷（m⁶A）是真核生物mRNA中最普遍的内部修饰，在调控mRNA稳定性、翻译效率及加工成熟等多个环节发挥关键作用。恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）是导致致命疾病——疟疾的顶复门寄生虫，其基因组具有极高的A+T含量（约90%）。前期研究发现，该寄生虫编码m⁶A写入蛋白（METTL3/METTL14同源物PfMT-A70和PfMTA-70.2）及读取蛋白（如含有YTH结构域的PfYTH.1，后者是多聚腺苷酸化复合体亚基CPSF4的同源物），但尚未鉴定出擦除蛋白。由于基因组高度A富集，传统的多聚腺苷酸化信号（如AAUAAA）在该物种中保守性较差，因此m⁶A修饰可能作为一种高阶信号参与界定3'末端加工位点。然而，此前缺乏单核苷酸分辨率的m⁶A图谱，且对多聚腺苷酸化位点的性质及选择性多聚腺苷酸化（APA）在基因表达中的贡献了解有限。为此，研究人员开展了此项研究，旨在绘制高分辨率m⁶A图谱并阐明其与mRNA 3'末端加工的时空关联。

主要技术方法

研究人员综合运用了以下关键技术：（1）DART-seq：利用APOBEC1-YTH融合蛋白诱导m⁶A邻近胞嘧啶发生C-to-U编辑，实现单核苷酸分辨率m⁶A定位；（2）MeRIP-seq：采用抗m⁶A抗体进行免疫沉淀后高通量测序，用于验证DART-seq结果；（3）PAT-seq与TE-seq：两种互补的全基因组3'末端测序技术，分别基于oligo-dT引物和非oligo-dT依赖的RNA接头连接策略，用于精确鉴定多聚腺苷酸化位点；（4）纳米孔直接RNA测序（Nanopore DRS）：对全长天然RNA进行测序，同时获取m⁶A修饰状态、化学计量比及转录本原生3'末端信息。样本来源为恶性疟原虫3D7株系的人红细胞内期（环状体、滋养体、裂殖体）同步化培养物及混合期培养物。

研究结果

1. 高分辨率m⁶A定位揭示发育阶段特异性和3'UTR偏好性

通过严格的DART-seq分析（要求两个生物学重复中均检测到相同基因组坐标的DRACH基序），研究人员在三个无性血液期共鉴定出2330个高可信度m⁶A位点，分布于1195个基因中。其中，73.6%的位点位于3'UTR，26.3%位于编码区，仅0.09%位于5'UTR。发育动态分析显示，涉及红细胞入侵、膜运输和宿主细胞重塑的基因（如GAP45、MSP4、GLURP、MESA等）表现出显著的阶段性m⁶A位点数量变化。MeRIP-seq验证显示，84.5%的DART-seq阳性基因位于MeRIP富集区域内，提供了区域性支持证据。

2. 多聚腺苷酸化位点的空间组织特征

PAT-seq和TE-seq两种独立方法均表明，切割和多聚腺苷酸化主要发生在基因组编码的极高A含量的序列区域内。与先前基于长读长cDNA测序的数据不同，TE-seq（避免oligo-dT内部引发）确认了多聚腺苷酸化位点下游紧邻区域存在突出的A峰，提示部分poly(A)尾可能包含基因组编码的A残基。进一步分析发现，大多数基因拥有多个多聚腺苷酸化位点，表明APA普遍存在。阶段间比较鉴定出数百个差异利用的多聚腺苷酸化位点，且APA影响的基因与差异表达基因有12%-14%的重叠，提示APA对阶段特异性基因表达有适度贡献。

3. 纳米孔DRS揭示m⁶A与转录本3'末端的关联

纳米孔DRS的宏基因分析证实m⁶A位点密度和化学计量比均在3'UTR远端（靠近切割位点）达到最高。混合期寄生虫的m⁶A化学计量比普遍高于环状体期。在APA基因中，单分子分析发现共享m⁶A位点在远端亚型中的占有率显著低于近端亚型（混合期平均差值为-0.28，环状体期为-0.15）。更重要的是，无论转录本使用近端还是远端切割位点，m⁶A在DRACH基序上的富集峰值均位于各自切割位点上游约30-50 nt处，而非固定于某一基因组位置。DART-seq与纳米孔DRS的核苷酸水平对比显示，77.8%的DART-seq位点与DRS检测到的m⁶A调用完全重合。

4. m⁶A与多聚腺苷酸化位点的空间关系

将纳米孔DRS衍生的m⁶A化学计量比与TE-seq定义的多聚腺苷酸化位点整合分析发现，m⁶A修饰频率在切割位点上游30-50 nt处达到峰值，该区域恰好对应典型多聚腺苷酸化信号（AAUAAA）最常出现的位置（约33 nt上游）。DRACH基序上的A修饰率可达45-50%，而非DRACH的A始终处于低修饰水平（约1%）。沿3'UTR从终止密码子向切割位点方向，DRACH位点中被归类为高置信度m⁶A的比例在最后三分之一段达到62.0%（混合期）和57.6%（环状体期）。

5. RNA二级结构与m⁶A及APA的协同关系

整合前期dsRNA结构组数据后发现，编码区的m⁶A位点显著富集于dsRNA峰附近（35.2%位于100 nt内），而3'UTR的m⁶A则与dsRNA峰分离。m⁶A化学计量比随距dsRNA峰距离增加而升高，提示局部结构可能限制甲基转移酶接近或稳定修饰。在APA背景下，近端和中间型多聚腺苷酸化位点附近dsRNA峰的出现频率（14.43%和16.92%）显著高于远端位点（3.05%），表明RNA结构可能更倾向于影响近端/中间切割位点的选择。

讨论与结论

本研究表明，m⁶A在恶性疟原虫中优先定位于3'UTR，并在切割位点上游30-50 nt处达到最大化学计量比，这一空间组织特征在真核生物中进化保守。鉴于该寄生虫基因组极端A富集导致传统AAUAAA信号保守性差，m⁶A富集于切割位点邻近区域的现象强烈提示，RNA甲基化可能有助于界定功能性3'末端加工信号。顶复门特有的CPSF30/YTH融合蛋白（即m⁶A读取蛋白作为核心多聚腺苷酸化复合体亚基）的存在，为m⁶A直接参与切割位点识别和APA调控提供了结构基础。单分子层面的证据表明，同一基因中近端和远端APA亚型在共享位点上呈现差异化m⁶A占有率，且m⁶A富集始终与各转录本实际使用的切割位点相关联，这进一步支持m⁶A可能在3'末端加工中发挥功能性作用的假说。综上所述，研究人员得出结论：m⁶A修饰与恶性疟原虫的mRNA 3'末端形成存在空间关联，数据与m⁶A可能促进3'末端加工的模型相一致，为后续探究该重要人类寄生虫中m⁶A介导的3'末端加工机制提供了框架。