《Genes》：Alternative Splicing of MBNL1 and MBNL2 Regulates the Nucleocytoplasmic Distribution of CUG RNA Foci in DM1 Cell Models
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背景/目的：强直性肌营养不良1型（myotonic dystrophy type 1, DM1）是成人发病肌营养不良症中最常见的类型。DM1由DMPK基因3′非翻译区中CTG三核苷酸重复序列的扩增引起。扩增的CUG重复RNA在细胞核中形成CUG RNA核斑，并
背景/目的：强直性肌营养不良1型（myotonic dystrophy type 1, DM1）是成人发病肌营养不良症中最常见的类型。DM1由DMPK基因3′非翻译区中CTG三核苷酸重复序列的扩增引起。扩增的CUG重复RNA在细胞核中形成CUG RNA核斑，并隔离RNA结合蛋白MBNL1，导致MBNL1功能丧失，进而引发剪接异常。MBNL1通过抑制编码其部分核定位信号的外显子5的包含来自主调控其核定位。在DM1中，由于MBNL1功能丧失，外显子5的包含增加。然而，外显子5的包含是否促进CUG RNA核斑的形成尚不清楚；本研究探讨了这一关系。方法：研究人员使用dCasRx（Cas13d的催化失活形式）以及靶向外显子5内部及其周围区域的引导RNA，以确定外显子5跳读的最优序列。根据所选序列设计了一种反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide, ASO），命名为ex5-ASO，并将其转染至细胞DM1模型和DM1患者来源的成纤维细胞中，以评估其对RNA核斑的影响。结果：ex5-ASO成功诱导了MBNL1外显子5以及MBNL2外显子5的跳读，且呈剂量依赖性。ex5-ASO转染后，MBNL1和MBNL2的胞质组分均增加。值得注意的是，ex5-ASO处理减少了核RNA核斑，并诱导了胞质核斑的出现。然而，尽管核RNA核斑减少且细胞核中仍残留大量MBNL1/2，ex5-ASO处理后错误剪接仍然持续存在。结论：MBNL1/2外显子5的包含水平影响核RNA核斑的形成，提示DM1中观察到的外显子5包含增加不仅是MBNL功能丧失的后果，还可能促进RNA核斑的核内积累以及MBNL1/2的隔离。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
强直性肌营养不良1型（myotonic dystrophy type 1, DM1）是最常见的成人发病型肌营养不良症，是一种累及多系统、多器官的疾病，包括骨骼肌、心脏、眼和中枢神经系统等。DM1的分子病理机制已较为明确：DMPK基因3′非翻译区中CTG三核苷酸重复序列的异常扩增，导致含有扩增CUG重复序列的RNA在细胞核内积累形成RNA核斑（RNA foci），并将Muscleblind-like家族RNA结合蛋白MBNL1及其旁系同源物MBNL2隔离于核斑中，造成MBNL蛋白功能丧失，进而引起下游大量靶基因前体mRNA的错误剪接，最终导致DM1的多系统临床表现。
MBNL1基因包含多个可变剪接外显子，其中外显子5的剪接对MBNL1蛋白的亚细胞定位至关重要。外显子5的包含会引入一段18个氨基酸的序列，该序列与外显子6编码的保守KRAEK基序共同构成双分型核定位信号（nuclear localization signal, NLS），促进MBNL1的核定位；而缺乏外显子5的MBNL1亚型则分布于细胞核和细胞质中。MBNL1还通过抑制自身前体mRNA外显子5的包含来实现自主调控，形成负反馈机制以维持核富集型与核质分布型MBNL1亚型之间的平衡。在DM1患者多种组织中，外显子5的包含增加，这可能导致MBNL1核定位增强，从而增加其被扩增CUG重复RNA隔离的易感性，加剧MBNL1功能丧失。
尽管已有研究表明MBNL1的表达水平和可变外显子影响CUG RNA核斑的动态变化，但外显子5对RNA核斑动态变化的直接贡献此前尚未被系统评估。本研究正是针对这一空白，设计了一种反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide, ASO）来诱导外显子5跳读，从而直接探究MBNL1和MBNL2外显子5的剪接状态对CUG RNA核斑核质分布的影响。
二、研究设计与技术方法
研究人员首先利用dCasRx系统（Cas13d的催化失活形式）结合靶向MBNL1外显子5及其侧翼区域的引导RNA，在HEK293-dCasRx细胞中筛选有效诱导外显子5跳读的靶序列，并据此设计出靶向5′剪接位点的ex5-ASO。该ASO为2′-O-甲基修饰的RNA，具有硫代磷酸酯骨架。随后，研究人员将ex5-ASO转染至HeLa-CTG细胞（一种携带约500–600个CTG重复序列的DM1细胞模型，受多西环素诱导表达）以及来自Coriell细胞库的DM1患者来源成纤维细胞（GM05151、GM04647和GM03987，分别携带约1500、1000和500个CTG重复），并以PromoCell来源的正常人真皮成纤维细胞（C-12302）作为对照。主要技术方法包括RT-PCR和RT-qPCR检测剪接模式、SDS-PAGE和Western blotting分析蛋白表达、亚细胞分级分离、RNA荧光原位杂交（RNA FISH）结合免疫荧光共聚焦显微镜成像，以及基于Fiji/ImageJ的图像定量分析。
三、研究结果
3.1 MBNL1外显子5跳读ASO的筛选与验证
研究人员利用dCasRx系统设计了五种引导RNA，分别靶向外显子5的3′剪接位点、5′剪接位点、外显子内部以及内含子4的两个区域。结果显示，靶向5′剪接位点的gRx-5′-ss最有效地诱导了外显子5跳读，而靶向3′剪接位点的gRNA无效，靶向内含子4的两个gRNA反而抑制外显子5跳读。基于此筛选结果，研究人员设计了ex5-ASO。在HeLa-CTG细胞中，ex5-ASO以剂量依赖方式有效促进MBNL1外显子5跳读，同时也诱导了同源序列高度保守的MBNL2外显子5跳读，但不影响MBNL1外显子7的剪接。在DM1患者来源成纤维细胞中同样获得了类似结果。
3.2 ex5-ASO改变MBNL1蛋白的亚型表达模式
通过延长电泳分离MBNL1含/不含外显子5的两种蛋白亚型，研究人员发现高浓度ex5-ASO处理后，不含外显子5的低分子量MBNL1亚型成为主要形式，MBNL2的蛋白亚型模式也发生类似改变，但MBNL1和MBNL2的总蛋白水平不受影响。免疫荧光分析显示，ex5-ASO处理后MBNL1和MBNL2的核质指数（nucleocytoplasmic index, NCI）均显著降低，表明两者向细胞质重新分布。亚细胞分级分离实验进一步证实，在CUG重复诱导条件下，ex5-ASO处理使细胞质中可检测到低分子量MBNL1亚型，相对核分布呈下降趋势。
3.3 ex5-ASO限制核CUG RNA核斑的形成
在HeLa-CTG细胞中，ex5-ASO处理显著减少了核CUG RNA核斑的数量，同时诱导了多个胞质核斑的出现。线剖面分析显示，ntASO处理的细胞中CUG RNA核斑与MBNL1的荧光强度分布高度重叠，而ex5-ASO处理后这种重叠减少；Pearson相关系数也相应降低。胞质核斑同样与MBNL2共定位。在多西环素诱导后再给予ex5-ASO处理，同样观察到类似效果，说明ex5-ASO即使在核斑形成后也能改变其分布。在DM1500和DM500成纤维细胞中，ex5-ASO显著减少了核CUG RNA核斑并增加了胞质核斑。值得注意的是，ex5-ASO处理后总DMPK mRNA水平不变，但胞质DMPK mRNA比例显著增加，提示核斑减少部分归因于DMPK mRNA向细胞质的转运增加。
3.4 ex5-ASO减少核CUG RNA核斑不足以纠正错误剪接
研究人员检测了DM1中已知的MBNL依赖性错误剪接事件NUMA1外显子2和CLASP1外显子19。在CUG重复诱导的HeLa-CTG细胞中，两者的外显子跳读均增加，但ex5-ASO处理未能纠正这些错误剪接。GOLGA2外显子3和SPTAN1外显子23的错误剪接同样未被纠正。在DM1患者来源成纤维细胞中，NUMA1外显子2的剪接模式也未因ex5-ASO而改变。
四、讨论与结论
本研究通过实验诱导外显子5跳读，揭示了MBNL1外显子5在CUG RNA核斑形成中的新作用。研究发现，外显子5跳读的诱导效果因gRNA靶向位置而异，说明剪接调控的复杂性；靶向5′剪接位点最为有效，而内含子4区域可能存在MBNL1结合的YGCY基序，提示内含子剪接沉默子的存在。ex5-ASO同时诱导MBNL1和MBNL2外显子5跳读，促进两者向细胞质重新分布。最关键的发现是，在不改变MBNL1/2总蛋白水平的情况下，仅通过亚型转换即可显著改变RNA核斑的数量和亚细胞分布，表明DM1中MBNL1/2外显子5包含增加不仅是MBNL功能丧失的后果，还可能促进核RNA核斑的形成。然而，尽管核RNA核斑显著减少，MBNL依赖的错误剪接并未得到纠正，提示减少可见核RNA核斑并不足以恢复MBNL蛋白的正常功能，核内可能仍存在不可检测为核斑的MBNL1/2隔离机制，或缺乏外显子5的MBNL亚型剪接调控活性较低。
研究结论：虽然已知MBNL1和MBNL2外显子5有助于其核定位，本研究进一步揭示外显子5的包含还参与CUG RNA核斑的核质定位。尽管ex5-ASO显著减少了核RNA核斑的数量，且细胞核中仍残留大量MBNL1和MBNL2，但错误剪接未能被纠正。MBNL1/2和DMPK mRNA的核水平与RNA核斑形成及剪接缺陷之间的关联机制仍不清楚，有待进一步研究。
