近红外光响应ZIF-8-pTA-LQ纳米体系通过可控释放l-Quebrachitol与温和光热效应协同促进骨缺损再生

《BIOMATERIALS RESEARCH》：Near-Infrared Light-Responsive Nanosystems with Controlled l-Quebrachitol Release and Photothermal Effect for Synergistic Bone Defect Regeneration

　　

近期研究突破凸显天然植物提取物在推进骨再生方面的潜力，其中l-Quebrachitol（LQ）作为一种有前景的多功能活性分子受到关注。LQ主要存在于无患子科、夹竹桃科和胡颓子科植物中，其独特治疗特性已引起重视。在本研究中，研究人员首先利用PharmMapper平台系统识别与LQ促骨形成和血管生成相关的药理靶点；随后开展一系列实验研究以揭示其潜在信号通路，阐明LQ作用的机制基础。针对生物半衰期短和体内快速降解等局限，研究人员进一步将LQ整合入先进药物递送系统，以提高其生物利用度和治疗潜力。沸石咪唑酯骨架-8（zeolitic imidazolate framework-8，ZIF-8）是一种金属有机框架（metal–organic framework，MOF），具有高度多孔结构和显著比表面积，是药物递送的理想候选材料。研究人员通过聚单宁酸（poly-tannic acid，pTA）表面修饰ZIF-8并将LQ包封于其孔结构内，构建了新型纳米复合物（ZIF-8-pTA-LQ）。该纳米复合物不仅实现LQ的可控释放，还表现出温和光热特性，在1.2 W/cm²近红外（near-infrared，NIR）照射下4 min内快速升温至~45 °C，并在10 min内稳定低于50 °C。该纳米系统促进磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路的后续激活，在骨缺损再生中表现出优异性能。该创新纳米颗粒平台将药物控释与光热治疗相结合，为骨组织修复提供了一种新颖且高效的方法，并为再生医学提供了有前景的新途径。

论文主体解读：骨缺损由疾病和事故引起，严重影响生活质量，而人体再生能力不足以修复大段骨缺损。临床治疗中，自体骨移植不引起排斥反应，并具有骨传导、骨诱导和成骨特性；但修复大缺损时会显著增加供区损伤和感染风险，且松质骨在移植骨中占比较大并常发生部分吸收或参与血管化。同种异体骨移植虽避免供区并发症，但来源稀缺、成本较高，且无血管化、与宿主骨整合能力有限，并存在疾病传播和免疫排斥风险。人工骨替代填充是当前常用选择，但手术技术要求较高、疗效观察期较长。因此，研究人员关注从天然植物中提取有效化合物用于临床。l-Quebrachitol（LQ）是一种天然光学活性肌醇甲氧基类似物，存在于橡胶乳汁和沙棘等植物中；其具有抗氧化、抗炎、抗糖尿病和抗癌等多种生物活性。d-Pinitol作为LQ异构体可抑制破骨细胞生成，但对成骨细胞生成无明显作用；Yodthong et al.报道LQ可能通过BMP、MAPK和Wnt/β-catenin信号通路促进小鼠前成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化和矿化。为克服LQ半衰期短和体内快速降解等限制，研究人员构建了ZIF-8-pTA-LQ纳米复合物，将LQ负载于ZIF-8并经pTA修饰，以实现控释和温和光热效应，并系统评价其促骨缺损再生作用及机制。该研究将LQ的PI3K/Akt激活作用与NIR诱导温和热疗上调热休克蛋白（heat shock protein，HSP）相结合，为血管化骨生成和骨缺损修复提供了新策略。

关键技术方法（不超过250字）：网络药理学（PharmMapper、GeneCards、RStudio交集及KEGG/GO富集）筛选LQ靶点；BMSCs（骨髓间充质干细胞）行CCK-8、ALP染色/活性、qRT-PCR、ARS及Western blot，并用LY294002抑制PI3K；合成ZIF-8、pTA修饰及LQ负载，SEM/TEM/EDS/FTIR/TGA表征，808 nm NIR评价光热、HPLC监测释放；构建大鼠颅骨缺损模型，行Microfil灌注-microCT、顺序荧光标记、H&E/Masson及免疫组化/免疫荧光。BMSCs来自3周龄Sprague–Dawley大鼠；动物实验用6周龄雄性Sprague–Dawley大鼠（200~250 g，上海吉辉实验动物有限公司）。

研究结果：（1）LQ-disease intersection target construction results：通过PharmMapper预测获得225个LQ潜在靶点，并在GeneCards中以相关性评分≥10筛选获得389个骨形成和血管生成相关基因；交集分析得到36个共同靶点，包括BMP2、ESR1、MMP13、MAPK1、TTR、CASP3、PPARG、EGFR、MAPK14、PTPN11、KDR和SRC等，为后续实验验证提供线索。（2）Results of the enrichment analysis of intersection targets：GO富集分析获得38个细胞组分、134个分子功能和1,716个生物学过程条目；KEGG富集获得131条相关通路，包括MAPK、PI3K-Akt、Ras及AGE-RAGE等信号通路，为LQ作用机制提供生物信息学支持。（3）In vitro mechanism research of LQ：CCK-8、ALP染色/活性和qRT-PCR显示20 μg/ml LQ作用最强，可提高ALP、OCN、OPN、RUNX2、COL-1和VEGF mRNA表达；Western blot显示LQ处理60和90 min后p-PI3K和p-Akt升高，LY294002可逆转上述变化及GSK-3β、β-catenin、ALP和成骨相关基因变化，表明LQ通过激活PI3K/Akt通路促进BMSCs成骨分化并上调VEGF。（4）Preparation and characterization of ZIF-8-pTA-LQ：SEM/TEM显示ZIF-8呈典型六边形、直径58.24 ± 9.04 nm，ZIF-8-pTA表面更粗糙并有壳层；EDS显示C、O含量增加；FTIR和TGA/DTG结果确认ZIF-8-pTA和ZIF-8-pTA-LQ成功合成。（5）Biocompatibility of ZIF-8-pTA-LQ：CCK-8显示ZIF-8-pTA和ZIF-8-pTA-LQ在150 μg/ml时第1、3、5天细胞活力明显下降，后续选用37.5和75 μg/ml。（6）Photothermal property of ZIF-8-pTA-LQ：37.5和75 μg/ml ZIF-8-pTA-LQ在808 nm NIR（1.2 W/cm²）下呈浓度依赖性升温；75 μg/ml约升温20 °C，而PBS约5 °C，4 min内快速升温后减缓并稳定在约45 °C；3次加热-冷却循环温度曲线和最高温度几乎一致，显示良好光热稳定性。（7）Controlled release of LQ induced by NIR：75 μg/ml条件下前12 h快速释放；酸性环境释放更明显，14 d最终释放量分别为95 ± 3.6%和80.63 ± 2.36%；中性条件下NIR组为22.2 ± 2.19%、无NIR组为18.5 ± 2.56%；NIR照射增强LQ释放，可能与热效应减弱静电相互作用、破坏氢键及增强分子布朗运动有关，该现象与Xu et al.和Kong et al.的报道一致。（8）Proliferation of BMSCs treated with mild hyperthermia：CCK-8显示ZIF-8-pTA和ZIF-8-pTA-LQ组第1、3、5天OD值较高，温和升温促进BMSCs增殖；NIR下ZIF-8-pTA-LQ与ZIF-8-pTA存在统计差异，提示NIR释放的LQ亦促进增殖；ZIF-8-pTA-LQ有/无激光组差异明显，提示激光加速LQ释放。（9）In vitro osteogenic differentiation of BMSCs treated with mild hyperthermia：7 d时NIR-ZIF-8-pTA-LQ组ALP染色最深、活性最高，其次为NIR-ZIF-8-pTA组；21 d时NIR-ZIF-8-pTA-LQ组ARS矿化最多；qRT-PCR显示RUNX2、COL-1、BMP-2、OPN和OCN上调，ZIF-8-pTA-LQ组高于ZIF-8-pTA组；HSP47、HSP70A、HSP70B和HSP70C mRNA在ZIF-8-pTA加NIR组上调，提示温和热疗通过HSP及LQ内在成骨作用促进BMSCs成骨分化。（10）In vivo cranial defect healing of ZIF-8-pTA-LQ with NIR irradiation：在大鼠颅骨缺损模型中，NIR照射下ZIF-8-pTA-LQ组30 s内由34.3升至39.3 °C，2 min后稳定于约41 °C，而SA组仅由35.3升至37.3 °C；4周Microfil灌注-microCT显示NIR-ZIF-8-pTA-LQ和NIR-ZIF-8-pTA组血管体积分数较大，前者微血管长入更多；8周micro-CT显示NIR-ZIF-8-pTA-LQ组BV/TV为41.41%，高于其他组，BMD、Tb.Th和Tb.N呈相同趋势；顺序荧光标记显示NIR-ZIF-8-pTA-LQ组荧光面积显著更大；TNF-α表达各组一致，主要器官未见明显病理变化；H&E和Masson染色显示NIR-ZIF-8-pTA-LQ组缺损区骨组织几乎完全整合，并见连续丰富蓝染及少量红染骨胶原；OPN/CD31免疫荧光在NIR-ZIF-8-pTA-LQ和NIR-ZIF-8-pTA组上调，LQ组更高；HSP47和p-Akt免疫组化显示NIR-ZIF-8-pTA和NIR-ZIF-8-pTA-LQ组HSP47表达面积较大（7.72 ± 1.10%和7.44 ± 1.42%），NIR-ZIF-8-pTA-LQ组p-Akt表达更广。上述结果证明该纳米系统通过LQ与光热治疗协同促进血管化骨生成。

讨论部分总结：研究指出，LQ在中性pH环境中的释放量相对较低，尽管骨缺损后形成轻度酸性环境，但其pH仍相对较高且短暂，释放水平可能不足以完全解释作用差异，因此未来应寻找更适合该纳米系统的药物分子。研究还提出，NIR可穿透较薄黏膜层到达植入部位并产生PTT，对下颌骨缺损以及暴露或感染骨缺损修复亦有益，显示临床转化潜力。研究结论翻译：总之，研究人员成功制备了具有LQ可控释放功能的光热ZIF-8-pTA-LQ纳米颗粒。体外实现了NIR照射下具有高效光热转换并可上调HSPs的温度（42~45 °C），并利用NIR对组织屏障的良好穿透性维持局部适度加热。实验结果还揭示NIR照射诱导LQ释放，并且通过LQ激活PI3K/Akt通路与上调HSPs mRNA表达相结合，NIR-ZIF-8-pTA-LQ组在血管化骨生成中表现优异。这种便捷而高效的光热方法在某些临床场景的骨缺损治疗中具有显著潜力。