胃饥饿素通过LSD1/Sp1/p62信号轴抑制铁死亡，缓解创伤性脑损伤小鼠的神经功能缺损

《Behavioural Brain Research》：Ghrelin Mitigates Neurological Deficits in Mice with Traumatic Brain Injury by Preventing Ferroptosis through the LSD1/Sp1/p62 Signaling Axis

　　摘要创伤性脑损伤（TBI）后，由铁依赖性脂质过氧化（铁死亡）驱动的继发性损伤会导致永久性神经功能缺损。尽管Ghrelin具有神经保护特性，但其在TBI后调节铁死亡中的作用尚不清楚。本研究旨在探讨Ghrelin对TBI后神经功能的影响，并阐明其潜在机制。通过控制性皮层撞击（CCI）建立小鼠TBI模型，在CCI诱导前1小时和后1小时腹腔注射Ghrelin。结果显示，Ghrelin改善了TBI小鼠的神经功能缺损、脑水肿和组织病理学损伤。此外，Ghrelin逆转了TBI诱导的Fe2?、活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）积累，并恢复了超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）水平。在分子水平上，Ghrelin下调了酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4），上调了铁蛋白重链1（FTH1）和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）。这些效应被铁死亡诱导剂Erastin共给药所消除。在TBI小鼠脑组织中，Ghrelin逆转了TBI诱导的赖氨酸特异性去甲基化酶1（LSD1）、特异性蛋白1（Sp1）和p62表达下调。一致地，体外实验表明，Ghrelin减弱了Erastin诱导的小鼠海马神经元细胞系HT22的铁死亡，并增加了LSD1、Sp1和p62的表达。机制上，Ghrelin上调LSD1表达，LSD1随后通过减少Sp1启动子处H3K9me2富集来促进Sp1转录，从而增强Sp1介导的p62转录激活。抑制LSD1或Sp1均部分减弱了Ghrelin的抗铁死亡和神经保护作用。本研究存在以下局限性：（1）体内机制验证仅依赖药理学抑制剂，且仅限于CCI模型；（2）LSD1/Sp1/p62信号轴在非神经元脑细胞中的作用尚不清楚，这些发现对临床TBI的适用性有限；（3）Ghrelin上调LSD1表达的上游机制仍有待阐明。总之，我们的研究结果表明，Ghrelin通过激活LSD1/Sp1/p62信号轴抑制TBI诱导的铁死亡，从而减轻神经功能缺损。我们的研究为Ghrelin治疗TBI提供了新的理论基础。引言创伤性脑损伤（TBI）是由外部机械力作用于大脑引起的一种严重神经系统问题，是全球死亡率和长期残疾的重要原因[1]。统计数据显示，全球每年约有5000万例TBI发生，给家庭和医疗服务带来沉重负担[2]。TBI的病理过程包括两个阶段：原发性损伤和继发性损伤[3]。原发性损伤是机械冲击直接导致的结果，引起神经元、胶质细胞、轴突和脑血管的即时结构损伤，该阶段在很大程度上不可逆且难以治疗干预。继发性损伤发生在创伤后数小时至数天内，包括一系列病理事件，如氧化应激、炎症、血脑屏障（BBB）破坏、脑水肿、线粒体功能障碍和细胞死亡[4]。与原发性损伤不同，继发性损伤随时间推移而发生，被认为是TBI后神经功能恶化和长期功能预后的主要因素[5]。因此，阐明驱动继发性脑损伤的分子机制并确定有效的干预靶点，对于改善TBI后的治疗策略和神经预后具有重要的临床意义。Ghrelin是一种由胃内分泌细胞合成的肽类激素。作为生长激素促分泌素受体（GHS-R）的内源性配体，它具有多种生物学功能，包括调节能量代谢、刺激食欲、抗炎、抗凋亡和抗氧化作用[6]。近年来的研究发现，Ghrelin能够穿过血脑屏障影响中枢神经系统，在脊髓损伤、缺血性脑损伤和TBI等神经系统疾病中发挥神经保护作用[7]。既往研究表明，Ghrelin通过触发AKT信号通路调节小胶质细胞极化平衡，从而减轻脑缺血损伤[8]。对TBI大鼠模型的研究表明，Ghrelin可通过下调bFGF和FGF-BP来减轻脑损伤并促进功能恢复[9]。然而，Ghrelin在TBI后提供保护对抗继发性损伤的确切下游过程尚未完全明确。铁死亡是一种由脂质过氧化激活并依赖铁的调节性细胞死亡过程。其核心特征包括细胞内铁积累、活性氧（ROS）过度产生、脂质过氧化产物堆积以及抗氧化防御系统受损[10]。越来越多的证据表明，铁死亡参与TBI后的继发性损伤。它不仅加剧神经元损伤，还通过破坏血脑屏障的完整性加重继发性脑损伤[11]，[12]。近年来，在理解TBI中铁死亡的调控机制方面取得了重要进展。Zhou等[13]发现TNFAIP3通过双向泛素化修饰稳定HMOX1并介导ACSL3降解，从而加重神经元铁死亡；抑制TNFAIP3可改善TBI诱导的认知障碍。此外，Zhu等[14]证明lncRNA Ntoco通过与Hnrnpab结合抑制NF-κB/Lcn2信号轴的激活，从而加剧TBI小鼠的神经元铁死亡。这些证据表明，铁死亡不仅是创伤后氧化应激的结果，也可能作为TBI中可干预的病理机制。因此，鉴定铁死亡的内源性或药理学调节因子可能为TBI提供新的治疗策略。赖氨酸特异性去甲基化酶1（LSD1），也称为KDM1A，是第一个被发现的组蛋白去甲基化酶。它通过介导组蛋白H3K4和H3K9的去甲基化来调节靶基因转录，并在神经发育和神经元分化中发挥重要作用[15]。研究表明，LSD1通过下调细胞外基质和细胞黏附基因表达，调节人神经干细胞中的神经发生并促进神经元分化[16]。除了在神经发育中的表观遗传功能外，LSD1在氧化应激和铁死亡中的参与最近受到越来越多的关注。研究表明，阻断LSD1可通过表观遗传下调激活转录因子4（ATF4）触发非小细胞肺癌细胞的铁死亡并阻止肿瘤发展，从而抑制胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白xCT的水平[17]。考虑到铁死亡与抗氧化系统功能障碍之间的密切联系，LSD1可能作为一种潜在的表观遗传调节因子，通过调节下游基因转录来影响铁死亡。p62是一种自噬受体蛋白，通过Keap1-Nrf2通路调节抗氧化反应并拮抗铁死亡[18]。早期研究表明，锌指转录因子特异性蛋白1（Sp1）与p62基因的启动子区域结合并增强其转录，从而触发细胞抗氧化信号[19]。尽管LSD1、Sp1和p62各自已被单独涉及抗氧化防御和铁死亡相关过程，但它们在TBI诱导的继发性脑损伤中的潜在调控关系仍不清楚。基于上述背景，本研究提出以下科学假说：Ghrelin可能通过激活LSD1/Sp1/p62信号轴抑制TBI后的神经元铁死亡，从而减轻继发性脑损伤并改善神经功能。为验证这一假说，我们使用控制性皮层撞击（CCI）建立小鼠TBI模型，系统研究Ghrelin对TBI后神经功能的影响。此外，我们在小鼠海马神经元细胞系HT22中使用Erastin诱导的铁死亡模型，进一步探索Ghrelin神经保护作用的分子机制。本研究可能揭示Ghrelin在TBI中的抗铁死亡效应，并为创建继发性脑损伤的治疗方法提供证据。章节片段实验动物雄性C57BL/6小鼠（8-12周龄，体重20-30克）购自北京维通利华实验动物技术有限公司。所有小鼠均饲养在SPF环境中，可自由获取食物和水。饲养条件如下：温度22±2°C，相对湿度50±5%，12小时光/暗循环。实验前给予小鼠至少一周适应期。使用计算机生成随机分配将小鼠随机分配到实验组。Ghrelin改善TBI小鼠的神经功能缺损和组织病理学损伤为研究Ghrelin如何影响TBI小鼠的神经功能，我们首先使用CCI方法建立小鼠TBI模型并用Ghrelin处理动物。损伤后，与假手术组相比，TBI组的mNSS评分显著升高，表明模型诱导成功（图1A）。与TBI组相比，Ghrelin治疗在观察期内降低了mNSS评分，表明Ghrelin减轻了TBI诱导的神经功能缺损（图1）。讨论TBI是一种危急的临床急症，初始创伤后进展的继发性损伤是永久性运动和认知功能障碍的主要原因。其病理生理学涉及氧化应激、神经炎症、线粒体功能障碍和多种调节性细胞死亡形式的相互作用[31]。目前TBI的治疗策略主要是支持性的，包括手术减压、颅内压管理和对症治疗。结论总之，本研究表明Ghrelin通过激活LSD1/Sp1/p62信号轴抑制TBI诱导的铁死亡，从而减轻TBI小鼠的神经功能缺损和脑组织损伤。机制上，Ghrelin通过上调LSD1表达减少Sp1启动子处H3K9me2富集，从而促进Sp1转录。Sp1进而激活p62转录，最终抑制神经元铁死亡。本研究不仅扩展了对伦理声明本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究经河北省人民医院医学伦理委员会批准。（批准号：2026-DW-129）资助本工作受河北省自然科学基金资助（H2024206437）。CRediT作者贡献声明张阔：可视化、方法学、数据管理。杨思慧：写作-原稿、方法学、调查、正式分析、概念化。孙国柱：写作-审阅与编辑、可视化、监督、方法学、概念化。杜一辉：验证、调查、正式分析。致谢无利益冲突声明作者声明不存在利益冲突。杨思慧|张阔|杜一辉|孙国柱