《Processes》：Determination of Calcium and Iron in Plant-Based Supplements and Foods
植物基膳食补充剂按食品类别监管，其原料组成多变，因此质量控制需要可靠的分析流程。研究人员开发、优化并验证了一种采用高分辨率连续光源火焰原子吸收光谱法（high-resolution continuum source flame atomic absorption spectrometry，HR-CS FAAS）测定钙和铁的方法。该方法包括微波辅助消解以及火焰原子化条件的优化，火焰高度为8 mm，镧释放剂浓度为0.4%，用于抑制钙测定中的化学干扰。钙和铁的检出限分别为0.13 mg L?1和0.02 mg L?1。方法准确度采用INCT-MP4-2（Mixed Polish Herbs）有证标准物质进行验证，并以加标回收试验加以补充。测定结果与标准值及加入量吻合良好，经95%置信水平的t检验确认。该流程应用于代表四种不同植物来源（荨麻、辣木、螺旋藻和小球藻）的16种市售植物基样品。每份铁含量范围为0.14至3.34 mg，而在所有受试产品中每份钙含量均不超过32.80 ± 0.46 mg。
研究背景方面，铁是人体必需元素，是血红蛋白和肌红蛋白的核心组分，参与氧气运输与储存，对生长发育不可或缺。铁日需求量取决于年龄、性别和膳食，成年女性达18 mg，妊娠期达27 mg。铁摄入不足可导致疲劳、注意力下降、头痛及免疫功能受损，缺铁在素食者和纯素食人群中尤为常见，因此铁膳食补充剂被广泛用于缺铁性贫血的预防和治疗。近年来，植物基铁补充剂日益受到关注，尤其受到素食者和纯素食者青睐。植物基铁补充剂常以荨麻（Urtica dioica）、辣木（Moringa oleifera）、螺旋藻（Arthrospira platensis）和小球藻（Chlorella vulgaris）等原料生产。荨麻叶和辣木叶被用作天然铁来源，干燥辣木叶约含25 mg铁/100 g，干燥荨麻叶通常含19 mg至200 mg以上铁/100 g干物质，取决于土壤条件和采收时间；但据报道辣木叶中铁的生物利用度较低。螺旋藻和小球藻虽在植物学意义上不属于植物，但含铁量显著更高，约为100 mg/100 g干生物量，常用于面向素食者的产品；不过螺旋藻中的铁主要以三价铁形式存在，生物利用度较低。同时，这些原料天然含有相当量的钙，荨麻约280至790 mg/100 g，干燥辣木叶超过2000 mg/100 g，螺旋藻补充剂超过1000 mg/100 g。因此植物基铁补充剂可同时提供这两种元素。
存在的问题在于，天然原料化学组成固有变异，目标组分通常仅占植物质量的小部分，样品溶解后还含有大量源自原料的其他化合物；活性物质含量可因物种、品种、环境条件和采收成熟度而在批次间存在差异，使植物来源活性物质的标准化相当困难。补充剂组成还受原料获取和加工方式影响，干燥和贮存条件以及粉碎程度可导致物质降解并影响可供提取的铁的比例。此外，由于土壤和水体污染，植物原料可能含有少量微生物污染物及农药和重金属等化学污染物，重金属可在人体组织中蓄积并引起肝损伤等毒性效应。为此，草药药品须经严格注册要求，对纯度、稳定性、生物利用度和临床疗效进行严格质量控制；相比之下，植物基膳食补充剂按食品监管，监督较少、控制频率较低且不够严格，可能对产品质量产生负面影响，这凸显了对植物基铁补充剂组成（包括钙等伴随元素含量）进行独立分析控制的必要性。除产品质量外，铁补充的有效性不仅取决于剂量，还取决于铁的生物利用度。植物来源产品特有的非血红素铁吸收较差，其吸收受膳食中钙、维生素C和多酚等其他组分强烈影响。钙是参与骨骼和牙齿结构以及细胞膜和多种酶功能的重要元素，推荐摄入量为每日1000至1300 mg，视生命阶段而定。植物基铁补充剂中钙的存在可抑制铁吸收，因此测定这些产品的钙含量对于评估其质量和实际营养价值十分重要。
植物基样品分析因其复杂基质而具有挑战性，铝、钛、硅酸盐、磷酸盐和硫酸盐等干扰物可与钙形成稳定化合物而降低分析信号。钙可采用ICP-MS、ICP-OES、火焰光度法、离子色谱法和EDTA络合滴定等多种技术测定，这些方法在灵敏度、选择性、成本和复杂性方面各有差异。其中火焰原子吸收光谱法（flame atomic absorption spectrometry，FAAS）应用最为广泛，其运行成本低、操作简单、分析时间短、重复性好且灵敏度足够，与等离子体仪器相比具有优势；其主要局限是不能同时进行多元素测定以及存在化学和光谱干扰的可能，可通过适当的样品制备、稀释以及使用电离缓冲剂或基体改进剂加以减少。膳食补充剂中的铁可采用类似的一系列分析技术测定，经典方法包括氧化还原滴定法和紫外-可见光谱法，这些方法简单廉价但灵敏度低于仪器技术且更易受样品基体干扰；原子光谱技术因此应用更广，FAAS可在补充剂典型浓度范围内于248.3 nm快速可靠地测定铁，而石墨炉原子吸收光谱法（graphite furnace AAS，GF-AAS）在铁含量低时提供更低的检出限；电感耦合等离子体技术ICP-OES和ICP-MS可同时多元素测定，包括铁与钙及其他伴随元素，但需要更昂贵的设备。多数技术需要完全矿化有机基体，最常用浓酸湿法消解，以获得可靠结果。
尽管FAAS应用广泛，关于植物基铁补充剂中钙和铁的数据仍然有限。HR-CS FAAS主要应用于饮料，关于补充剂的报道集中于铁和锌而不含钙。钙是荨麻、辣木、螺旋藻和小球藻的主要天然组分，消解后在样品溶液中与磷酸盐、硅酸盐及其他抑制钙信号的组分以显著浓度共存，这使得此类基质中钙的测定比简单溶液更具挑战性，释放剂使用条件应在真实植物基质中加以验证。此外，钙可抑制非血红素铁吸收，因此应在同一产品中测定这两种元素。本研究旨在开发并验证用于植物基补充剂和食品中钙和铁的HR-CS FAAS流程，在有证植物基质中优化镧浓度，并测定每份提供的钙和铁量，可结合已报道的钙铁相互作用加以考虑。尽管这些结果提供了质量控制和标签核验所需的精确总量分析数据，但并不意味着直接的生理可利用性，后者受复杂的膳食和代谢相互作用影响。
研究人员开展的研究为：开发、优化并验证了HR-CS FAAS测定钙和铁的流程，包括微波辅助消解和火焰原子化优化，火焰高度8 mm，镧释放剂浓度0.4%用于抑制钙测定中的化学干扰；钙和铁检出限分别为0.13 mg L
?1和0.02 mg L
?1；采用INCT-MP4-2（Mixed Polish Herbs）有证标准物质验证准确度并以加标回收试验补充；测定结果与标准值及加入量吻合良好，经95%置信水平t检验确认；该流程应用于代表四种不同植物来源（荨麻、辣木、螺旋藻和小球藻）的16种市售植物基样品；每份铁含量范围为0.14至3.34 mg，而所有受试产品每份钙含量均不超过32.80 ± 0.46 mg。其意义在于所提出的HR-CS FAAS流程是用于复杂植物基质中总矿物含量严格分析控制的稳健工具，同时须将总组成值与实际生理可利用性明确区分。
主要关键技术方法概述（不超过250字）：研究采用聚焦微波高压特氟龙罐消解（UniClever，2450 MHz，最大功率300 W，密闭110 mL TFM-PTFE消解罐，约500 mg样品经H
2O
2预润湿后加65% HNO
3和40% HF，300 W辐照15 min，温度约208 °C、压力约15 atm），以HF实现生物硅和矿物硅酸盐完全溶解；采用ContrAA 700高分辨率连续光源原子吸收光谱仪（300 W氙短弧灯，9 A），分析线422.7 nm（钙）和248.3 nm（铁），10 cm燃烧器缝，铁用贫燃空气-乙炔焰（乙炔65 L h
?1、空气490 L h
?1），钙用富燃（还原性）焰（乙炔90 L h
?1、空气相同），以ASpect CS 2.3.1软件评估，用峰高定量；校准采用七点外标法，以连续校准验证（continuing calibration verification，CCV）标准监控系统稳定性。样品队列来源为：从当地药房和杂货店购买16种市售食品产品和膳食补充剂（粉末、片剂和散装产品），每种产品购自不同批次的五包并合并为每产品一个混合样，样品按销售状态分析、未干燥且结果未作水分校正；有证标准物质INCT-MP4-2（Mixed Polish Herbs）购自波兰华沙核化学与技术研究所；另制备水提物（2.5 g干燥材料或单个茶包，250 mL沸高纯水浸泡15 min，0.22 μm PTFE滤膜过滤）以评估钙和铁的水可提取部分。
研究结果方面，3.1火焰高度的优化：火焰高度影响原子化阶段从而影响分析信号，过低则原子化不完全、过高则原子电离或扩散，两者均使吸光度下降；通过在4至10 mm范围内测定同一标准溶液吸光度随高度的变化，钙标准为2 mg L
?1（存在0.5% w/v La）、铁标准为1 mg L
?1，两种分析物吸光度均在8 mm处达最大，故选用该值用于后续分析；此阶段所用0.5%镧浓度处于随后在有证材料基质中发现的平台（0.4–0.6%）之内，预计不影响火焰高度的选择。3.2镧浓度的优化：钙的FAAS测定须考虑磷酸盐、硫酸盐和铝等干扰物，磷酸盐和硫酸盐可与钙形成低挥发性化合物阻碍原子化并降低信号强度；向溶液中加入镧盐可抑制基体影响，镧对干扰物的亲和力大于钙，能与之结合而释放钙，限制稳定钙化合物的形成，使火焰中游离钙原子数增加、吸光度信号升高；通过在已优化的8 mm火焰高度下测定吸光度随镧浓度的变化进行优化，为重现真实植物样品基质，采用稀释至钙浓度2 mg L
?1的INCT-MP4-2有证标准物质消解液（该材料富含钙，认证值10.8 g kg
?1，与分析产品上限范围0.3–9.9 g kg
?1相当）；文献中镧用量依应用而异，在0.1%至1.0%（w/v）之间；本研究以0.1%为步长测试0.0–0.6%（w/v La，测定溶液中最终浓度），吸光度信号在镧浓度0.4%（4 g L
?1 La）处达到平台，进一步增加未引起信号显著变化，故后续分析采用0.4%，此为平台上的最低浓度，也限制了镧引入的背景噪声；由于优化在有证植物材料消解液而非纯钙标准中进行，所选浓度考虑了样品溶液中与干扰物（磷酸盐、硫酸盐、铝和硅）共存的钙，且低于此前HR-CS FAAS研究所用的1% La；钙的校准标准、程序空白、CCV标准、加标溶液和样品溶液均维持相同La浓度。3.3分析品质因子：检出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）按IUPAC建议以LOD = 3 SD/m和LOQ = 10 SD/m确定，其中SD为同一空白溶液（含0.4% La并与消解液相同酸基质）连续十次空白测量的标准偏差，m为校准曲线斜率；由此得LOD为0.13 mg L
?1（钙）和0.02 mg L
?1（铁），相应LOQ为0.43和0.07 mg L
?1；这些值高于Zambrzycka-Szelewa等报道的HR-CS FAAS值（无释放剂时铁LOD 2.8–3.5 μg L
?1、LOQ 9.4–11 μg L
?1，钙LOD 3.6 μg L
?1、LOQ 12 μg L
?1；加入1%镧后该研究中钙LOD增至85 μg L
?1、LOQ 285 μg L
?1，与本研究中含镧条件下所得值处于同一数量级）；本研究所得LOD也与其他作者对速溶咖啡冲泡液直接分析的结果相当；铁LOD（0.02 mg L
?1）比文献值（0.04 mg L
?1）低两倍，而钙LOD较高（0.13 vs. 0.03 mg L
?1），钙LOD较高可归因于镧的加入，镧虽对抑制复杂基质中化学干扰必不可少，但可能增加背景噪声从而增大空白标准偏差；方法精密度良好，钙的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.3–3.4%，铁为1.2–3.3%，由每个样品消解液连续五次测量计算，这些值表征测量重复性，不包括独立消解间的变异；每次运行开始时新鲜制备七点外标校准曲线，线性在钙1–8 mg L
?1和铁0.5–6.0 mg L
?1工作区间内验证，以最低校准标准为工作范围下限，所有样品溶液均在此范围内测量，代表性方程为y = 0.0536x + 0.0407（R
2 = 0.9978）和y = 0.0711x ? 0.0073（R
2 = 0.9985）；当R
2 ≥ 0.995且各校准点反算浓度在标称值±10%以内时校准被接受，代表性运行中钙反算浓度偏离标称值?3.0至+6.1%、最大绝对残差0.013吸光度单位并伴有残差轻微弯曲，铁偏离?1.5至+5.6%、最大残差0.015吸光度单位；采用CCV标准监控系统稳定性和潜在漂移，两种元素的回收率接受标准为90–110%。3.4准确度验证：采用INCT-MP4-2有证标准物质（certified reference material，CRM）进行验证，选用该材料作为替代物是因为没有针对膳食补充剂的CRM；INCT-MP4-2提供钙的认证值和铁的信息值（未认证）；方法重复性基于CRM消解液连续五次测量的标准偏差评估，95%置信水平的学生t检验显示实验结果与参考值无显著差异；钙的测定值（10.3 ± 0.5 g kg
?1）在其不确定度范围内与认证值（10.8 ± 0.7 g kg
?1）一致；铁仅有未给出不确定度的信息值，故一致性（回收率104%）仅具指示性，铁测定的准确度和耐用性主要依赖在所有评估食品和补充剂基质中进行的全面消解后加标回收试验；该一致性表明方法适用于消解后植物基基质中钙和铁的测定；由于HF可能通过形成难溶CaF
2导致钙损失，用HF消解CRM的钙回收率（95%）和加标回收率（94–106%）验证未发生显著损失，消解液在测量前也经稀释并向钙溶液加入La。3.5标准加入试验：为进一步验证方法准确度，通过向样品中加入已知量钙和铁进行回收试验，对16种产品和每种元素在单一水平（钙1.0 mg L
?1、铁0.5 mg L
?1）于消解后引入分析物制备加标溶液，回收率以加标溶液测定量减去未加标溶液量再除以加入量计算，t检验比较五次测量均值与加入量；测定量与加入量吻合良好（回收率94–106%），95%置信水平学生t检验显示无显著差异，这些发现确认了所提出流程在膳食补充剂和食品复杂基质中测定钙和铁的准确度。3.6膳食补充剂和食品中钙和铁的测定：为评估方法的实际适用性，在既定实验条件下采用外标校准分析样品；所报道的样品SD值描述仪器测量的重复性，不包括批次间或独立消解间的变异，因此结果指每产品的混合样；铁含量在受试植物基产品间差异显著，无论总浓度（mg 100 g
?1）还是每份含量（mg/单次剂量）；总铁浓度范围为MP2的16.6 ± 0.2 mg 100 g
?1至NT2的153.2 ± 2.6 mg 100 g
?1，但评估每份提供的铁量时，最高为CT2（3.34 ± 0.09 mg），其次为CP2（1.82 ± 0.05 mg）和CT1（1.77 ± 0.02 mg），最低为MT1（0.14 ± 0.01 mg），其次为MT2（0.17 ± 0.01 mg）；NL和NH的每剂值为转移入冲泡液的量而非总含量，对NL，2.5 g部分总含量约为23.6 mg钙和0.67 mg铁，约51%的钙和约25%的铁转移入饮料，由于这一差异，NL和NH未纳入下文产品间每份含量的比较；这些发现表明高铁浓度不一定转化为高每份铁含量，后者在很大程度上取决于制造商推荐的份量；从营养角度看，铁摄入对素食者和纯素食者尤为重要，因为植物性膳食仅提供非血红素铁，其生物利用度（通常5–12%）显著低于动物来源的血红素铁（15–35%），因此素食者和纯素食者的铁推荐膳食允许量（Recommended Dietary Allowance，RDA）估计高出1.8倍；每份铁含量较高的产品（如CT和CP系列）可对这些更高需求做出实质贡献，例如一份CT2约提供成年女性18 mg RDA的19%，或约1.8倍更高需求的10%；相反，每份铁含量极低的产品（如MT1、NL或MT2）可能不足以支持缺铁性贫血的预防。钙浓度和每份含量在所分析植物来源样品间分布更为分散，总浓度范围为CT1的31.4 ± 0.4 mg 100 g
?1至SP1的988.4 ± 12.8 mg 100 g
?1；就每份钙量而言，最高为MP2（32.80 ± 0.46 mg）和SP1（29.70 ± 0.39 mg），而NT2和CT1提供可忽略的量（分别为0.33 ± 0.01 mg和0.46 ± 0.01 mg）；SP1和MP2的高钙含量可能反映螺旋藻和辣木天然富含钙的组成而非有意强化；由于严格纯素食者完全排除乳制品这一西方膳食中钙的主要来源，他们常依赖强化植物产品和植物基补充剂以满足每日需求并维持骨密度，然而此处发现的最高值（32.80 mg）也仅覆盖最低推荐日摄入量1000 mg的约3%；同一植物来源产品间每份钙含量也差异显著（如SP1 vs. ST1和MP2 vs. MT1），反映不同制造商产品形式和份量的差异。除产品特异性差异外，粉末产品每份提供的钙多于片剂；作为探索性比较，以产品为实验单元进行单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）（粉末n = 6，片剂n = 8，散装草药和草药茶NL和NH被排除）：F(1,12) = 12.9，p = 0.004；为确保统计有效性并避免伪重复，采用每个独立市售产品（SKU）的均值作为单一观测而非仪器技术重复，仅反映测量精密度；每份平均钙含量粉末为17.7 mg、片剂为1.29 mg；该比较仅描述所分析的这组产品，各组在植物来源方面不平衡（荨麻仅以片剂形式可得），且每个产品来自不同制造商、配方和份量不同（粉末约3–5 g，片剂约0.3–3.1 g），因此观察到的显著差异强烈受这些配方变量和制造商规定份量的混杂影响而非物理形式本身；以每100 g产品表示时差异较小（均值463 vs. 157 mg 100 g
?1；F(1,12) = 5.1，p = 0.04），表明份量对此有贡献。在对照商业定位评估这些产品时，针对铁供给的产品与一般植物来源食品之间呈现明显区别；微藻产品（小球藻和螺旋藻系列）常作为浓缩营养支持品向素食者营销，这反映在本研究中观察到的其每份铁贡献较高；相反，荨麻和辣木产品通常作为传统膳食原料，无明确的铁靶向治疗声称；关于标签符合性，多数评估产品包装上缺乏具体的定量矿物声明，这对于按标准食品法而非药品框架监管的植物基食品是典型的；在少数声明营养值的情况下，测定浓度在市场可接受公差范围内，验证了不存在未经授权的矿物强化。所评估多矿物基质的一个关键方面是同一份中钙和铁的共存，可能导致吸收阶段的相互作用；钙以剂量依赖方式抑制血红素和非血红素铁的吸收，其机制尚未完全阐明，抑制发生在肠上皮细胞水平，可能涉及二价金属转运中的竞争或细胞内转运途径的调节；对素食者和纯素食者，这一相互作用尤为相关，因为植物性膳食天然富含植酸盐、多酚和草酸盐，强烈抑制非血红素铁吸收，同时提供铁和钙的补充剂可加剧这一问题；结果显示任何受试样品每推荐份的钙含量均不超过33 mg（0.3–32.8 mg）；人体研究中钙以剂量依赖方式抑制非血红素铁吸收，所考察剂量范围为每餐40至600 mg钙，但效应大小还取决于钙的化学形式、餐食组成（特别是植酸盐）以及与补充剂同时摄入的其他膳食来源的钙；由于本研究未测定铁吸收和生物利用度，数据不足以得出这些产品中钙是否影响铁吸收的结论。必须批判性地强调，总分析组成代表产品中元素存在的化学上限，而生理可利用性由从食品基质释放并被肠上皮细胞吸收的部分决定；由于方法使用强无机酸完全分解样品，不能区分不同化学形态或解释人体消化的酶促和物理屏障。即使在此范围内，产品中两种元素的相对比例也不同；作为组成指标，每份Ca:Fe摩尔比约为SP1的29（29.70 ± 0.39 mg钙和1.44 ± 0.02 mg铁）和MP2的约55（32.80 ± 0.46 mg钙和0.83 ± 0.01 mg铁），而CT2约为0.5（1.11 mg钙和3.34 mg铁）、CP2约为3.0（3.96 mg钙和1.82 mg铁）；这些比例仅描述产品组成，不是生理效应的证据，不应单独用于预测铁吸收，后者取决于两种元素的化学形式和餐食组成，且本研究未评估。
讨论部分总结：本研究开发了微波消解后以HR-CS FAAS测定钙和铁的流程，并利用参考材料（钙认证、铁信息值）和加标回收试验对所分析基质（荨麻、辣木、小球藻和螺旋藻基产品）进行验证；在有证植物基质中优化镧浓度并对两种元素采用单一微波消解，使全部16种产品中两种元素均得以测定；在所分析产品（每种一个混合样，按销售状态）中，每份铁含量范围为0.14 mg（MT1）至3.34 mg（CT2），每份钙含量范围为0.33 mg（NT2）至32.80 mg（MP2），对NL和NH这些为转移入冲泡液的量；在此组中，粉末每份提供的钙多于片剂（探索性比较），该差异可能反映植物来源、配方、制造商和份量；总之，所提出的HR-CS FAAS流程是用于复杂植物基质中总矿物含量严格分析控制的稳健、非假设性工具；然而，必须将这些总组成值与实际生理可利用性明确区分，后者的评估需要补充的体外胃肠消化模型或体内研究；未评估铁吸收和生物利用度，因此这些数据不足以就铁生物利用度、缺铁预防或产品的营养有效性得出结论。
