RIF：融合伪标签半监督图神经网络与双预处理集成的可解释细粒度空间域识别框架

《Cell Reports Methods》：An interpretable deep learning framework for revealing fine-grained spatial domains

空间转录组学（spatial transcriptomics, ST）能够在保留空间背景的情况下实现基因表达谱分析，但准确的空间域界定仍然具有挑战性。研究人员提出RIF，一种稳健且可解释的深度学习框架，用于细粒度空间域识别（fine-grained spatial domain identification）。RIF利用经伪标签（pseudo-labels）半监督训练的图神经网络（graph neural networks, GNNs）以保持组织结构完整性。其引入双预处理集成策略（dual-preprocessing ensemble strategy）以提升模型稳健性和泛化能力。其进一步通过网络可解释性实现空间可变基因（spatially variable genes, SVGs）检测。在多个测序平台上，RIF在空间域识别中优于最先进的对比算法。在小鼠脑组织中，RIF识别出空间分离的背侧和腹侧区域中对应的海马亚区（hippocampal subfields），并解析了嗅球（olfactory bulb）的层状组织。在乳腺癌中，RIF界定的空间域提示T细胞（T cell）活性受抑制，且与缺氧和氧化微环境相关。在包含超过720,000个细胞的浸润性导管癌（invasive ductal carcinoma, IDC）数据集中，RIF界定的空间域提示上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）梯度，包括激素依赖性降低和细胞外基质（extracellular matrix, ECM）重塑。

研究背景：组织内细胞空间组织是理解器官发生、疾病机制和肿瘤免疫等过程的基础。空间转录组学（spatial transcriptomics, ST）可在保留空间坐标的同时量化基因表达，但空间域识别（spatial domain identification, SDI；划分共享分子特征或生物学功能的区域）仍具挑战：ST数据稀疏、高维，需要降维去噪；空间信息整合需谨慎，过度依赖会掩盖细微结构。现有基于主成分分析（PCA）的线性方法仅能划分较简单区域，难以捕捉基因间非线性关系；基于图神经网络（GNNs；在图上进行消息传递的深度学习模型）的方法虽能学习非线性嵌入，但常受“过度平滑”和“过度挤压”影响，导致边界模糊、空间分离但功能相似区域难以归并，且可扩展性、稳健性和跨数据集/技术泛化性不足。SDI与空间可变基因（spatially variable genes, SVGs；表达具空间自相关的基因）检测多未统一，跨切片空间域注释转移有限，ST中的可解释深度学习亦较少。为此，研究人员开发RIF，以统一细粒度SDI、SVG检测和注释转移，并提升跨平台稳健性与可解释性。

关键技术方法：RIF以缩放和非缩放基因表达为双输入，构建空间K近邻图；PCA后乘邻接矩阵生成空间感知表示，高斯聚类筛选低不确定性伪标签；训练两个GNN执行半监督域分类和基因填补任务，并以混合二部图公式（HBGF）聚类集成融合结果；冻结分类网络后，为每个域训练SVG选择器；注释转移将基因表达分解为基因特异和spot特异成分，并用平衡焦点损失。所用公开数据包括10× Visium小鼠脑、人背外侧前额叶皮层（DLPFC）、人乳腺癌、Xenium人IDC、Stereo-seq小鼠嗅球、Slide-seq V2小鼠嗅球、MOSTA小鼠胚胎、osmFISH小鼠皮层和Slide-tags小鼠海马等。

结果：

RIF概述：RIF包含SDI、SVG检测和注释转移三个模块。通过双预处理、伪标签监督的GNN训练、基因填补和聚类集成，模型在保持组织结构的同时增强域特异性；通过解释已训练网络识别区分各域所需的最小基因集；注释转移通过分解批次效应相关成分实现参考与目标切片间标签一致。

RIF delineated dorsal and ventral hippocampi in mouse brain：在Visium小鼠脑矢状面前后切片中，RIF较好描绘小脑皮层层状结构和纹状体平滑域，并识别空间分离的背侧和腹侧海马亚区，包括CA1、CA2、CA3及DGmo、DGpo、DGsg等；STAGATE遗漏背侧DGmo，SEDR和ConSpaS难以区分CA1/CA3且遗漏腹侧结构。RIF在前、后切片分别检测879和733个SVGs，重叠412个；Ddn在DGmo高表达，Olfm1在DGsg高表达；其SVGs空间自相关优于SpatialDE、SPADE、SOMDE及t检验。

RIF achieved robust clustering performance on human dorsolateral prefrontal cortex：在12张人DLPFC切片（3名供者，每供者4张，手动注释6层皮层和 white matter）中，RIF的调整兰德指数（ARI）和归一化互信息（NMI）表现稳定；中位ARI的95%置信区间宽度为0.08，小于GraphST的0.15；切片151674的ARI为0.64，轮廓系数（SC）为0.32，UMAP显示簇内紧凑、簇间分离，PAGA轨迹清晰呈现层级结构。RIF检测415个SVGs，Moran’s I最高、Geary’s C最低；基因本体（GO）富集581个条目，涉及神经元通讯、突触功能、轴突/树突结构和神经递质信号。注释转移在DLPFC各切片准确率均超过0.8，切片151671达0.91。

RIF captured spatial variations and T cell suppression in breast cancer：在人乳腺癌（HBRC）Visium数据中，RIF的ARI为0.58，高于SEDR的0.49和GraphST的0.46，并保留肿瘤边缘等细粒度结构，SC为0.15。结合反卷积和单样本基因集富集分析（ssGSEA），从DCIS/LCIS到健康组织，缺氧、细胞外酸性、细胞内碱性和氧化应激呈下降趋势；含CD8⁺ T细胞的spot中，T细胞活性在DCIS/LCIS和IDC区域受抑制，在周围肿瘤和健康区域较高；蛋白酶体通路在肿瘤区域高于健康组织。RIF检测938个SVGs，空间自相关高于t检验、SpatialDE、SPADE和SOMDE；SVGs分层为健康高表达和肿瘤高表达两类，分别富集于正常细胞功能和凋亡相关通路。

RIF dissected tumor heterogeneity in full-sample-area Xenium data：在全样本区Xenium人IDC数据（超过720,000个细胞）中，其他对比方法难以扩展。RIF识别空间散在免疫浸润域、两个基质域和肿瘤相关域；GO显示免疫域富集TNF超家族细胞因子产生正调控，基质域富集TGF-β产生调控，肿瘤域富集乳腺发育等胚胎/发育通路。肿瘤域8高表达ESR1、PGR和SSTR2，呈luminal样、低侵袭；域3高表达AGR3，呈较低组织学级别；域5富集CEACAM6和FASN，呈高侵袭特征。肿瘤核心与基质间的过渡域中PGR渐降，MMP2、ZEB2和POSTN升高，提示激素依赖性降低并获ECM降解/重塑能力的EMT梯度。

RIF demonstrated generalizability across high-resolution datasets and diverse platforms：在Stereo-seq小鼠嗅球（MOB，19,109个细胞）中，RIF区分RMS、MCL等精细层，STAGATE合并EPL和GL，SEDR对RMS困难；检测251个SVGs，包括Pcp4和Gabra1，富集神经功能相关GO/KEGG。在Slide-seq V2 MOB（20,139个细胞）中，RIF及其变体准确捕获MOBipl、MOBmcl和MOBepl等层，GraphST混淆GCL/IPL，STAGATE混淆MCL/EPL，DeepST未区分AOB；注释转移与SDI一致。MOSTA E9.5（8张切片，bins 5,900–121,767）中，仅RIF、STAGATE、GSG、STMGCN和SpaceFlow在可用GPU内存内完成全部SDI；RIF识别腔隙结构和环形心脏区域。osmFISH小鼠体感皮层（5,328个细胞，33个基因）中RIF取得最高ARI；Slide-tags小鼠海马（839个细胞）中RIF识别空间散在少突胶质细胞，检测497个SVGs，平均Moran’s I为0.64，富集神经递质转运等GO条目。

讨论总结：作者系统回顾现有SDI方法，指出GNN类方法空间先验过强导致过度平滑和过度挤压；RIF以伪标签监督域分类、基因填补任务和双预处理集成增强细粒度结构与稳健性，并将SDI与SVG检测通过网络解释相连接，注释转移通过分解基因特异和spot特异成分减轻批次效应。多平台评估显示RIF在准确性、稳定性和表示质量方面具优势。作者同时指出局限：注释转移主要面向相对均质的相邻切片，假定参考切片存在对应空间域，不完全等同于队列水平分析；SVG解释模块仅用于SVG识别，不能精确识别特定域的标志基因；RIF尚未整合H&E或多组学等多模态信息。研究结论翻译：总之，RIF为分析ST数据提供了一个用户友好的工具包，研究人员预期其将在空间组学研究中获得更广泛和更灵活的应用。