负载let-7a-5p工程化细胞外囊泡的生物活性支架促进节段性气管缺损的免疫调节与功能性再生

《Bioactive Materials》：A let-7a-5p-engineered extracellular vesicle-laden bioactive scaffold promotes immunomodulation and regeneration of segmental tracheal defects

　　

本研究旨在开发一种负载let-7a-5p（微小RNA let-7a-5p）工程化细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）的生物活性支架，用于促进节段性气管缺损的免疫调节与再生修复。研究人员构建了一种机械匹配的聚己内酯（polycaprolactone, PCL）/泊洛沙姆F127（Pluronic F127）支架，可实现EV的局部持续递送。let-7a-5p工程化EVs能够促进修复性巨噬细胞极化。该生物活性支架能够增强血管与黏液纤毛上皮再生。在兔节段性气管缺损模型中，该支架能够减轻气管狭窄并提高动物存活率。机制研究表明，let-7a-5p-EVs可抑制核因子-κB（nuclear factor kappa B, NF-κB）相关的炎症激活。

节段性气管缺损是胸外科与组织工程领域面临的重大挑战，常由肿瘤切除、创伤或先天畸形引起。当缺损长度超过约6 cm或累及成人气管50%以上时，直接端端吻合往往难以实施。尽管自体组织转移、同种异体移植物、合成假体、脱细胞基质及组织工程支架等技术不断进步，长段气管缺损的可靠重建仍是未解难题。现有方法的主要局限在于对局部再生微环境的调控不足：持续性炎症可激活促炎巨噬细胞并引发细胞因子释放、组织损伤与纤维化；血管化不足限制氧供与营养输送；上皮修复延迟则使管腔易受刺激、感染及肉芽组织形成。这些过程相互交织，最终导致移植物失败和术后气道狭窄。因此，如何在单一构建物中整合机械支撑、免疫调节剂持续递送及上皮再生的时空协调，成为气管再生的关键科学问题。

针对上述挑战，Bing Liu、Na Wei、Lirong Liang、Zhiqiang Shi、Ping Liu、Tian Zeng、Haopeng Zhang及Hui Zhang等研究人员开展了一项集成化研究，开发出一种由机械优化三层聚己内酯（polycaprolactone, PCL）框架与负载let-7a-5p（微小RNA let-7a-5p）富集细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）的20%泊洛沙姆F127（Pluronic F127）热敏水凝胶组成的复合生物活性支架。该论文发表于《Bioactive Materials》。研究旨在回答该集成系统能否有效协调巨噬细胞免疫调节、血管再生与黏液纤毛上皮修复，并将材料设计与明确的免疫调节机制相联系。研究结论表明，该支架能够在单一构建物中整合机械支撑、EV可控释放与局部免疫调节，为长段气管重建提供了同时应对机械与生物学障碍的新策略，也为免疫再生植入物提供了将材料特性、治疗释放与免疫调控工程化的综合设计框架。

研究人员综合运用了熔融电写（melt electrowriting, MEW）结合挤出式3D打印构建双层PCL管状支架；利用慢病毒载体转导的人牙龈间充质干细胞（human gingival mesenchymal stem cells, hGMSCs）经差速超速离心分离获得let-7a-5p工程化EVs；通过系统比较不同浓度F127水凝胶的微观结构、黏弹性、降解曲线、EV释放动力学及体外细胞相容性，筛选20% formulation作为EV储库；并建立新西兰大白兔1 cm节段性气管缺损原位模型，结合转录组测序（RNA-seq）、双荧光素酶报告实验及蛋白免疫印迹（Western blot）等技术手段解析分子机制。其中，hGMSCs组织样本来源于五名18至25岁健康供体，经伦理委员会批准并签署知情同意书。

let-7a-5p富集的细胞外囊泡的工程化与表征显示，逆转录定量PCR（RT-qPCR）证实let-7a-5p在EV中的相对丰度较未修饰EV提升约80倍；透射电镜与纳米颗粒跟踪分析显示EVs呈典型球形膜泡结构，主峰粒径分布于50至150 nm；免疫印迹与免疫金标证实了EV阳性标志物CD9、CD81、CD63的表达；共聚焦显微镜观察证实气道上皮细胞可高效摄取PKH26标记的EVs。

F127水凝胶优化以实现EV持续递送的系列研究表明，扫描电镜显示随浓度升高水凝胶孔径由55.33±2.52 μm降至22.67±4.51 μm；20%水凝胶具有约0.4 kPa的适中储能模量，第42天质量损失约70%，在降解与EV保留间取得平衡；细胞计数kit-8（CCK-8）实验显示各组细胞相容性良好且20%组促增殖效果最佳；近红外成像显示20%组皮下植入28天后仍保留约45%初始荧光信号，显著优于其他浓度组。

机械匹配型生物活性气管支架的构建结果显示，三层PCL框架的弯曲刚度为11.52±1.11 MPa·m，与原生兔气管（11.41±1.28 MPa·m）高度匹配，而两层结构支撑不足、四层结构刚性过强；径向与轴向压缩刚度接近天然气管生物力学范围；爆破压测试表明PCL/F127复合支架与原生气管压力抗性无显著差异。

let-7a-5p-EV支架体外促进巨噬细胞免疫调节的研究通过Transwell共培养体系证实，经脂多糖（LPS）诱导的炎症巨噬细胞在let-7a-5p-EV支架处理后，CD206/CD86荧光强度比值与流式细胞术检测的CD206阳性细胞比例均显著升高；免疫印迹显示M1标志物iNOS与CD80下调，M2标志物ARG1、MRC1及抗炎因子IL-10上调；酶联免疫吸附测定（ELISA）显示促炎因子IL-1β与TNF-α分泌减少；收集的条件培养基可显著促进气道上皮细胞划痕愈合与血管内皮细胞成管形成。

let-7a-5p-EV支架体内生物相容性评价显示，兔皮下植入2周后各组均未见广泛坏死、严重急性炎症浸润或明显异物巨细胞反应；let-7a-5p-EV组CD31阳性内皮信号及血管屏障成熟标志物ZO-1表达增强；主要器官组织学检查未见病理损伤。

let-7a-5p-EV支架在兔节段性气管缺损模型中的体内疗效研究表明，术后6周let-7a-5p-EV组气道连续性更佳，管腔狭窄率显著低于其他组；支气管镜显示管腔表面更光滑；Kaplan-Meier生存分析显示该组存活率为88.89%，高于PCL组（33.33%）、F127组（44.44%）及EV组与let-7a-5p组（各50.0%）；组织学显示该组气道壁结构更趋规则，相对管腔面积约8.5 mm²为各组最大。

let-7a-5p-EV支架增强血管成熟与黏液纤毛上皮重建的免疫荧光分析表明，CD31与ZO-1整合密度显著增加，提示血管生成与成熟；MUC5AC与β-tubulin表达显著增强，提示黏液分泌细胞与纤毛细胞再生；Collagen I阳性面积比最低，CD206/CD86比值最高，证实纤维化减轻且巨噬细胞向M2型极化。

转录组分析提示let-7a-5p介导修复中的NF-κB相关炎症调控显示，RNA-seq显示let-7a-5p-EV组与EV组转录组显著分离；京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析提示NF-κB信号通路下调；免疫荧光显示磷酸化p65（p-p65, Ser 536）核定位及p-p65/p65总蛋白比值显著降低；双荧光素酶报告实验证实let-7a-5p直接结合IKBKB与RELA的3′非翻译区（3′ UTR）并抑制其表达；核质分离免疫印迹显示let-7a-5p-EV减少核内p65/p-p65并恢复胞质水平；let-7a-5p抑制剂可逆转上述效应，证实治疗作用依赖于let-7a-5p。

讨论部分指出，现有气管移植物或缺乏机械完整性，或难以控制炎症与血管化，或制备流程过于复杂。本研究通过三层PCL框架实现力学匹配，以20% F127作为物理交联储库平衡EV保留与组织长入，利用工程化EVs保护let-7a-5p并赋予其优于游离miRNA的免疫调节效力。然而，水凝胶在长期力学载荷下的稳定性、EV规模化生产的均一性以及长段缺损和慢性炎症环境下的疗效仍需进一步验证。研究同时承认，1 cm兔模型与6周观察期不足以评估长期重塑，且未设已验证阳性对照，终点分析可能存在存活者偏倚。

研究结论表明，负载let-7a-5p工程化EV的PCL/F127生物活性支架能够通过局部持续释放EV，在维持气道通畅的同时减轻管腔狭窄、改善生物力学恢复、促进血管成熟与黏液纤毛上皮重建，并通过抑制IKBKB/NF-κB信号轴减弱炎症激活，从而提高节段性气管缺损模型中的动物存活率，代表了一种具有临床转化前景的免疫调节性气道重建策略。