《Biocatalysis and Agricultural Biotechnology》：Mixed-culture reverse screening of
Lactiplantibacillus plantarum yields a mutant with an
spxB SNP that boosts ethyl acetate in Baijiu fermentation
编辑推荐：
•开发了一种基于表型驱动的合成微生物组反向筛选策略。•突变体植物乳杆菌 ARTP-HEA-001将乙酸乙酯产量提高了41.29%。•全基因组重测序揭示了一个调控性spxB SNP（p.Tyr49His）。•突变体将乙酸（作为酯化前体）的含量提高了6.3倍。•该范式将育种从“超级个
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开发了一种基于表型驱动的合成微生物组反向筛选策略。
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突变体植物乳杆菌 ARTP-HEA-001将乙酸乙酯产量提高了41.29%。
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全基因组重测序揭示了一个调控性spxB SNP（p.Tyr49His）。
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突变体将乙酸（作为酯化前体）的含量提高了6.3倍。
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该范式将育种从“超级个体”转变为“团队协作者”。
引言
传统食品发酵中关键风味化合物的合成本质上是一个群落水平的过程，由复杂的微生物相互作用所协调（Wu等，2021；Kang等，2024）。中国白酒是这一原理的典型代表，其关键香气成分的产生高度依赖于固态发酵微生物组内的协同代谢。在这些代谢产物中，乙酸乙酯至关重要，因为它是清香型白酒中典型的风味决定因子，其浓度直接决定酒的质量和市场价值（Lin等，2024；Xu等，2021）。其感官特性随浓度变化显著，高浓度时赋予典型的果香（如苹果和香蕉），低浓度时则呈现梨或菠萝般的香气（Xu等，2021；Wei等，2020）。此外，“陈酿酒风味更佳”的现象与储存期间乙酸乙酯的动态形成密切相关（Xu等，2021；Wei等，2020；Ru等，2024），因此，在酿造过程中提高其合成量已成为产品高端化的核心目标（Qu等，2023）。
在复杂的白酒微生物群落中，存在明确的代谢分工。酿酒酵母是酒精发酵的主要媒介，贡献核心乙醇含量，并作为乙酸乙酯的关键产生者（Dong等，2019）。毕赤酵母常作为辅助酵母，参与酯类的形成并增强香气的复杂性（Fu等，2021）。米曲霉作为糖化剂，将淀粉分解为可发酵糖，为发酵提供碳源基础（Gao等，2022；Xia等，2023；Tu等，2022）。地衣芽孢杆菌分泌多种酶，促进淀粉降解，并可能有助于独特风味化合物的形成（Tang等，2023）。乳酸菌，特别是植物乳杆菌，是该网络的核心，通过代谢产生乳酸和乙酸等有机酸。这不仅调节酸度并促进风味的柔和，更重要的是，为酵母进行的酯化反应提供了不可或缺的前体（乙酸）（Chen等，2022）。这五个特定菌株的选择反映了生态学研究的共识，即这些属构成了驱动白酒发酵中醇、酸和香气形成的核心功能微生物群（Wang等，2019；Wang等，2022；Luo等，2023；Jin等，2017）。
这种种间合作构成了风味合成的基石，意味着像植物乳杆菌这样的菌株的功能改良必须考虑其生态相互作用。传统的微生物诱变方法，如常压室温等离子体（ARTP），可以有效地生成具有丰富多样性的突变体库（Fang等，2013）。然而，越来越多的研究表明，后续的筛选策略通常依赖于在简化的人工培养基上评估单菌落表型（例如，生长速率、产酸圈），这与工业现实严重脱节。这种“单菌株到单菌株”的筛选模式与工业发酵的现实严重脱节，无法预测菌株在复杂微生物群落中的实际表现，导致许多有潜力的突变体在混合培养发酵中应用时表现不佳（Kang等，2024；Wu等，2021）。这种差异是当前工业菌株改良的主要瓶颈。
因此，我们假设在功能相关的微生物群落中直接施加选择压力，可以有效弥合实验室筛选与工业性能之间的差距。本研究设计并实施了一种反向、表型驱动的筛选策略，在模拟白酒发酵生态系统中直接考察ARTP诱变的植物乳杆菌文库。以乙酸乙酯产量为主要适应度标准，该方法旨在绕过纯培养预筛选的局限性，实现目标突变体在混合培养系统中的直接富集。为进一步验证所选优良突变体的遗传稳定性和分子基础，将全基因组重测序纳入工作流程，以鉴定增强的群落水平性能背后的特定突变谱。该策略建立了微生物育种的新范式——从选择“个体高性能者”转向具有明确基因组修饰的“高效团队协作者”——可广泛应用于多种复杂发酵食品的发酵剂精确改良。
章节片段
菌株来源与种子培养制备
本研究使用了五种微生物菌株：酿酒酵母 BS-19、米曲霉 M-08、地衣芽孢杆菌 NB-06、植物乳杆菌 ATCC-8014和毕赤酵母 C-02。除植物乳杆菌 ATCC-8014购自北京生物资源保藏中心（BJBCC）外，所有其他菌株最初均从安琪酵母股份有限公司提供的白酒大曲中分离得到。这些大曲分离株是野生型工业菌株，并已保存
通过创新筛选策略成功获得目标突变菌株植物乳杆菌 ARTP-HEA-001
传统的ARTP诱变育种通常依赖于单菌株水平的表型筛选，所得突变菌株在复杂发酵群落中的适应性和功能性往往难以预测（Yan等，2026）。例如，在乳酸菌的诱变筛选中，常规方法可以分离出产酸能力增强的突变体，但这些菌株在发酵系统中的综合性能及其
对复杂发酵系统中菌株育种的启示
本研究建立了一种由混合培养发酵表型驱动的新型ARTP诱变筛选策略，并成功将其应用于提高实验室规模白酒酿造系统中植物乳杆菌的乙酸乙酯合成能力。该方法绕过传统单培养水平的预筛选，直接将突变体文库置于模拟真实酿造生态的固态混合培养发酵系统中，以终端风味
CRediT作者贡献声明
李欣： 资金获取、初稿撰写、审阅与编辑、正式分析。 闫春月： 方法学、项目管理、软件、正式分析、初稿撰写、可视化、监督、调查、数据管理、概念化。 陈雄： 资金获取、初稿撰写、审阅与编辑、调查
数据可用性
支持本研究结果的数据可从通讯作者李欣处获得，经合理请求即可获取。
利益冲突声明
作者声明，他们已知的、可能影响本论文报告工作的竞争性经济利益或个人关系不存在。
致谢
本工作得到了2024年省级自然科学基金创新发展联合基金的资助[资助号2024AFD152]。
闫春月|李欣|陈雄
