《Animals》：Diet-Associated Gut Microbiome Divergence Contributes to Phenotypic Differentiation Among Geographically Structured Populations of Rana dybowskii
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地理表型变异是自然种群中普遍存在的特征，通常由局部环境异质性和营养互作驱动。尽管肠道微生物组已被认为是连接环境资源与宿主生理的关键中介，但其在两栖动物适应性分化中的作用仍未得到充分探索。本研究采用整合方法——结合形态学测量、基于DNA宏条形码（DNA meta
地理表型变异是自然种群中普遍存在的特征，通常由局部环境异质性和营养互作驱动。尽管肠道微生物组已被认为是连接环境资源与宿主生理的关键中介，但其在两栖动物适应性分化中的作用仍未得到充分探索。本研究采用整合方法——结合形态学测量、基于DNA宏条形码（DNA metabarcoding）的食性分析以及16S rRNA测序的肠道微生物谱系分析——对东北林蛙（Rana dybowskii）三个地理种群（丹东[DD]、抚顺[FS]和本溪[BX]）进行了调查。结果表明，DD种群的形态特征（体重、头体长、后肢长等）显著高于FS和BX种群。通过肠道内容物DNA宏条形码进行的食性分析识别出不同的食物结构；值得注意的是，DD种群消耗了更高比例的双翅目（Dipteran）猎物（如Smittia属）。相应地，肠道微生物群表现出显著的种群水平聚类。研究人员在DD种群中鉴定出特定功能细菌的富集，例如Arthrobacter属，该属以几丁质降解能力著称，与其摄入富含几丁质的昆虫猎物相一致。Mantel检验进一步证实了食性组成、微生物群落结构与宿主形态特征之间的强相关性。这些发现表明，饮食驱动的肠道微生物组变异与R. dybowskii在不同栖息地间的表型分化所起的作用相一致，尽管因果关系仍有待直接验证。通过将营养生态学与微生物景观相结合，本研究为异质环境中两栖动物的适应性进化和资源管理提供了新的见解。
论文解读
一、研究背景与科学问题
地理表型变异是自然种群中普遍存在的生物学现象，其根源在于气候、资源可利用性和栖息地结构等空间异质性产生了不同的选择压力，从而塑造种内多样性并驱动种群间的表型分化。在两栖动物中，这种地理变异常表现为体型、体色和生活史特征的差异。例如，红眼树蛙（Agalychnis callidryas）的腿部颜色随纬度降低逐渐从橙色过渡为紫色；安第斯毒蛙（Epipedobates anthonyi）不同种群间存在遗传和表型分化；日本树蛙（Hyla japonica）的雄性广告鸣叫特征受山脉和开阔海域等地理屏障影响而呈现种群间差异。
饮食是连接环境异质性与宿主生理和表型的关键生态界面。栖息地特定的猎物可利用性不仅影响营养摄入，还塑造肠道微生物群的组成和功能，进而介导营养同化与代谢。然而，尽管学界对宿主相关微生物组的生态作用日益关注，饮食驱动的肠道微生物组变异对地理结构化的两栖动物种群间表型分化的贡献仍知之甚少。已有研究多为描述性研究或局限于单一种群，往往独立关注肠道微生物组成或宿主性状，缺乏在空间尺度上将饮食、微生物组结构和表型变异明确关联起来的整合研究。
东北林蛙（Rana dybowskii）是中国东北、俄罗斯远东和朝鲜半岛特有的两栖动物，主要栖息于长白山山脉及其山麓地区。该物种兼具重要的生态和经济价值，近年来养殖业的扩张引发了因易地引种和引入导致的遗传多样性降低的担忧。初步观察表明，地理隔离的R. dybowskii种群在体型和肢体形态上存在显著差异，提示局部环境条件可能影响其生长发育。然而，针对该物种的饮食、微生物群和表型整合研究仍然缺乏。因此，本研究旨在评估三个地理种群间饮食和肠道微生物群落的差异，并检验饮食驱动的肠道微生物组变异是否构成所观察到的表型分化的基础。
二、研究设计与技术方法
研究人员于2025年4月从中国辽宁省三个地理种群——丹东（DD）、抚顺（FS）和本溪（BX）采集了共计1254只成年R. dybowskii个体，其中362只来自BX、478只来自DD、414只来自FS。所有个体在冰上运输至沈阳农业大学动物繁殖实验室进行形态学测量，由单一观察者使用相同仪器完成体重、头体长、头长、头宽、吻长、前臂手长、前臂宽、后肢长、胫长、足长和大腿长等指标的测定。随后随机选取16只成年蛙（8雌8雄）用于肠道微生物群和食性分析，其中6只（3个复合样本，各含1雌1雄）用于肠道微生物群分析，其余10只（5个复合样本）用于食性分析。
研究采用的主要关键技术方法包括：第一，基于16S rRNA基因V3-V4区扩增子的高通量测序技术，使用Illumina NovaSeq PE250平台进行双端测序，通过QIIME2 2024.10平台和DADA2插件进行序列处理和扩增子序列变异（ASV）推断，并对照SILVA 138参考数据库进行物种分类注释；第二，基于线粒体COI基因的DNA宏条形码（DNA metabarcoding）技术，使用节肢动物靶向引物对NoPlantF_270和mICOIintR_W扩增约250–300 bp的片段，在Illumina PE150平台测序后，通过BLAST比对参考COI数据库进行猎物物种鉴定；第三，形态学测量与多元统计分析，包括单因素方差分析（ANOVA）和Duncan多重比较检验、Kruskal–Wallis检验、基于Bray–Curtis距离的主坐标分析（PCoA）和非度量多维尺度分析（NMDS）、置换多元方差分析（PERMANOVA）、冗余分析（RDA）和典范对应分析（CCA）、Spearman秩相关分析以及Mantel检验等。
三、研究结果
3.1 肠道微生物群落组成
在门水平上，所有样本的肠道微生物群以变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）四大优势菌门为主，合计占总微生物群落的98.6%以上。在科水平上，假单胞菌科（Pseudomonadaceae）为关键优势科，DD组的微球菌科（Micrococcaceae）相对丰度高于其他组。在属水平上，Pseudomonas为整体优势菌属，DD组中Iodobacter和Arthrobacter显著富集。在α多样性方面，Simpson指数在各组间保持稳定（p = 0.73），但Chao1指数显示显著的地理变异（p = 0.039），FS种群的微生物丰富度最高，BX居中，DD最低。基于Bray–Curtis距离的PCoA分析显示微生物群落呈明显聚类（PC1: 30.1%，PC2: 21.8%），证实地理位置是这些森林蛙肠道微生物β多样性的重要驱动因素。
3.2 饮食组成
在目水平上，双翅目（Diptera）在三个种群中均占最高比例，而脉翅目（Neuroptera）在BX中比例最高，在DD和FS中较低。在科水平上，毛蠓科（Psychodidae）在FS和BX种群中最丰富，而摇蚊科（Chironomidae）在DD种群中占优势。在属水平上，Sergentomyia在FS中相对丰度最高，Smittia和Chrysotus在DD中占优势但在BX和FS中几乎不存在，BX中Phaneroptera和Sergentomyia共同贡献了较大比例的饮食。在物种水平上，Smittia aterrima在DD种群中的相对丰度显著高于FS和BX组。α多样性分析显示，DD组在Pd_faith指数上显著高于FS和BX组（p < 0.05），在Observed species指数上显著高于FS组。β多样性分析中，饮食组成的PCoA（PC1: 26.78%，PC2: 22.34%）呈现与微生物群落一致的模式。Wilcoxon秩和检验显示，DD种群在属水平上显著富集摇蚊科猎物，特别是Smittia和Polypedilum；而FS种群中Sergentomyia的相对丰度显著高于DD组。
3.3 形态分化与环境背景
形态学比较揭示了三个R. dybowskii种群间的显著表型分化。在雌性中，DD种群持续表现出最大的体型，体重、头体长（SVL）、头长、吻长、前臂手长、前臂宽、足长和大腿长均显著高于FS和BX种群（p < 0.05）；在后肢长和胫长方面，DD和BX雌性在统计学上相当且均显著超过FS雌性。在雄性中，DD种群也表现出更大的形态性状值，体重、SVL、头宽、吻长、前臂手长、后肢长、胫长和大腿长显著大于BX对应值（p < 0.05），而SVL、头宽、前臂手长、前臂宽和胫长显著大于FS雄性（p < 0.05）。环境方面，DD具有最高的年平均温度（10.1 °C）和最高降雨量（1322.1 mm）以及较高的森林覆盖率（74.5%），而FS的降雨量（786.7 mm）和温度（7.2 °C）最低但日照时数最长（2367.2 h）。
3.4 肠道微生物和饮食组成结构的决定因素
基于Bray–Curtis距离的PERMANOVA分析检测到强烈的种群效应，肠道微生物群（R2 = 0.4237，p = 0.001）和饮食组成（R2 = 0.4635，p = 0.001）均显示地理分组解释了相当大比例的变异。DD种群表现出显著更高的SVL和体重（p < 0.05）且分布紧密聚集，而BX种群在这两个性状上表现出明显更大的离散度，FS种群呈现中间模式。种群内分析显示，仅在BX种群中体重显著解释了肠道微生物群和饮食组成的变异，而SVL无显著效应；DD和FS种群中未检测到显著关联。
3.5 饮食组成与肠道微生物群的耦合
优势饮食类群与细菌属之间的相关性分析显示，Iodobacter、Arthrobacter和Deefgea等细菌类群与特定饮食昆虫（尤其是摇蚊科相关类群如Smittia和Polypedilum）存在强相关性，这些猎物在DD种群中高度富集。相比之下，FS和BX种群特征性的饮食类群（如Sergentomyia、Gryllotalpa、Myrmeleon和Phaneroptera）与肠道微生物类群（涉及Paracoccus、Acinetobacter和Yersinia等属）的关联较少且变异较大。值得注意的是，FS和BX种群均表现出相对较弱且不一致的饮食–微生物群关联，表明饮食驱动的微生物结构化强度降低。
四、讨论与结论
讨论部分指出，三个采样区域虽同处长白山山脉西南延伸段且共享温带季风气候，但环境条件存在差异。DD种群较大的体型与其独特的环境特征（最高年均温、最高降水量和较高森林覆盖率）密切对应，温暖气候可加速代谢过程和生长速率，较高降雨量和适中湿度条件支持更高的昆虫猎物资源可利用性。饮食组成的地理差异反映了猎物可利用性和觅食策略的显著变异：DD的温暖湿润条件促进了Smittia、Polypedilum和Chrysotus等水生和半水生昆虫的发育；BX较高的森林覆盖率有利于偏好森林边缘和灌木栖息地的Phaneroptera增殖；FS较低降水量和森林覆盖率但较高太阳辐射的干燥开阔栖息地适宜Sergentomyia和Gryllotalpa等土壤和植被相关昆虫。
在DD种群中，Arthrobacter与Smittia之间存在强正相关。Arthrobacter属以其几丁质分解能力著称，可产生几丁质酶和几丁质脱乙酰酶等胞外酶，高效降解结晶几丁质为可利用的碳氮源。摇蚊类群具有快速种群增长和同步大量羽化的特征，在短时间内产生大量猎物生物量，这种高摄入驱动的几丁质通量，结合Smittia相对柔软的外骨骼增强底物生物可利用性，共同促进了肠道微生物群中Arthrobacter等几丁质降解菌的富集。BX种群中Yersinia及其相关猎物Phaneroptera的相对丰度较高且呈显著正相关，可能与昆虫血淋巴内增殖相关的毒力和适应基因以及森林土壤环境储库有关。FS种群中Sergentomyia与Paracoccus和Acinetobacter呈显著正相关，提示猎物相关微生物群可能是两栖动物宿主肠道微生物组装的重要来源。
结论部分指出，本研究证明DD、FS和BX种群的地理变异导致饮食组成和肠道微生物群的显著差异，这些差异与宿主形态变异密切相关。以摇蚊科猎物为主的丹东种群表现出与高效营养利用相关的独特微生物谱系，并展现出更大的体型和生长相关性状值。相比之下，抚顺和本溪更多样化但偏向陆生的饮食与更高的微生物多样性和环境来源及机会性类群的富集相关。研究结果与以下框架一致：环境异质性塑造饮食结构，饮食与肠道微生物组成共变，这些因素共同与宿主表型分化共变。然而，该观察性研究是相关性的，所提出的饮食–微生物群–表型因果链仍属假设，需要通过受控条件下的饮食和微生物群直接实验操作来确立因果关系。
