益生菌与蛋白酶协同对丝尾鳠生长性能、消化酶活性、生理及血液免疫反应的影响

《Animals》：Effects of Dietary Protease at Different Levels of Probiotics on the Growth Potential, Enzyme Activities, Physiological and Hematoimmune Responses of Striped Catfish (Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878))

　　

本研究探讨了益生菌（Prob）和外源蛋白酶（Prot）对丝尾鳠（Pangasianodon hypophthalmus）生长指标、消化酶和抗氧化酶活性、体成分、血液免疫参数及血清生化指标的交互作用。实验采用2 × 5因子设计，配制了粗蛋白水平为35.23%的十种饲料，分别在每种蛋白酶水平（0.5和1.0 g/kg）下添加不同水平的益生菌（0.0、1.0、2.0、3.0和4.0 g/kg）。经过14天驯化后，将鱼随机分为十组，每组三个重复（每缸20尾鱼），进行为期90天的喂养试验。结果表明，在两个蛋白酶水平下，益生菌补充均显著改善了生长性能。在0.5 g/kg蛋白酶水平下，终末体重（FBW）和增重（AWG）随益生菌添加量增加而升高，在4.0 g/kg益生菌时达到最高均值；然而，增重率（WG%）在2.0 g/kg益生菌时最高（498.49%），饲料转化比（FCR）最低（1.33），更高益生菌水平下无进一步显著改善。相比之下，在1.0 g/kg蛋白酶水平下，最优益生菌水平移至1.0 g/kg，此时WG%为486.99%，FCR为1.37。类似地，消化酶和抗氧化酶对膳食Prot和Prob的响应中，主效应和交互效应均显著。然而，丙二醛（MDA）、白细胞（WBC）和肝酶水平显著下降，与生长趋势相反。此外，血液免疫学参数包括红细胞计数（RBC）、血红蛋白浓度（Hb）、血细胞比容（HCT）、溶菌酶活性和免疫球蛋白M（IgM）在0.5 g/kg蛋白酶搭配4.0 g/kg益生菌时达到最高均值，但在2.0、3.0和4.0 g/kg益生菌处理间差异不显著。在1.0 g/kg蛋白酶水平下，这些参数通常在1.0–2.0 g/kg益生菌时显示最高均值。此外，两种添加剂对常规营养成分（粗蛋白、粗脂肪、水分和灰分）均无显著影响（p > 0.05）。基于WG%的多项式折线回归分析表明，在0.5 g/kg蛋白酶条件下，最优益生菌水平为1.46 g/kg；而在1.0 g/kg蛋白酶条件下，最优益生菌水平估计为1.39 g/kg。总之，饲料中添加Prob和Prot可增强丝尾鳠的生长和健康状况，为集约化养殖提供了一种可持续且经济的方案。

研究背景与目的

水产养殖是全球重要的营养食品来源，但如何在降低饲料成本的同时提升鱼类生长性能和健康水平仍是重大挑战。随着鱼粉短缺和价格上涨，植物蛋白源在水产饲料中的应用日益广泛。然而，植物原料中含有抗营养因子（ANFs）且氨基酸不平衡，限制了鱼类的消化吸收效率。为解决这一问题，研究者开发了多种营养策略，其中外源酶制剂（如蛋白酶）和益生菌因其在改善饲料利用、促进生长和维护健康方面的潜力而备受关注。外源蛋白酶可将大分子蛋白质降解为生物可利用的小肽和氨基酸，提高植物蛋白利用率并缓解ANFs的负面影响；益生菌则能调节肠道微生物群落、增强养分利用和免疫功能。尽管两者各自的作用已有较多报道，但其在丝尾鳠（Pangasianodon hypophthalmus）植物性饲料中的交互效应尚缺乏研究。丝尾鳠是全球重要的经济养殖鱼类，生长快、饲料转化率高、适应性强，在巴基斯坦等南亚和东亚国家养殖规模不断扩大。因此，本研究的目的是评估在植物性基础饲料中联合添加益生菌和外源蛋白酶对丝尾鳠生长性能、消化酶和抗氧化酶活性、体成分、血液免疫参数及血清生化指标的交互影响，旨在为集约化养殖提供可持续且经济的营养调控方案。

研究方法概述

本研究采用2 × 5双因素完全随机设计，共配制10种等氮（粗蛋白35.23%）的实验饲料。两个因素分别为蛋白酶（CIBENZA DP^?，600,000 U g^-1）添加水平（0.5和1.0 g/kg）和益生菌（Compro Napro? [PR-24]，含Bacillus licheniformis 5.0×10⁹ CFU/g、Bacillus subtilis 5.0×10⁹ CFU/g和Enterococcus faecalis 5.0×10⁸ CFU/g）添加水平（0.0、1.0、2.0、3.0和4.0 g/kg）。实验鱼（n=600，初始体重约10.17±0.03 g）购自巴基斯坦拉合尔私人孵化场，经15天驯化后随机分配到30个玻璃水族箱（70×40×40 cm，100 L水），每箱20尾，每组3个重复，饲喂90天，日投喂量为体重的3%。研究期间监测水质参数（水温24–28°C，溶氧5–6 mg/L，pH 7.31–7.74，氨氮0.14±0.02 mg/L）。实验结束时，每组随机取鱼用于各项指标测定：5尾用于全鱼体成分分析；7尾分别取肠道和肝脏组织检测消化酶和抗氧化酶活性；4尾采血于EDTA管进行血液学分析；另4尾采血制备血清用于生化及免疫指标检测。数据采用双因素方差分析（two-way ANOVA）及Tukey HSD多重比较检验，并使用多项式折线回归分析确定最优添加水平。

研究结果

3.1 丝尾鳠的生长指数

益生菌和蛋白酶及其交互作用对终末体重（FBW）、平均增重（AWG）、增重率（WG%）和特定生长率（SGR）均有显著影响（p < 0.001）。在0.5 g/kg蛋白酶水平下，FBW和AWG随益生菌添加量增加而升高，在4.0 g/kg时达最高均值；但WG%在2.0 g/kg益生菌时最高（498.49%），FCR最低（1.33），2.0、3.0和4.0 g/kg组间无显著差异。在1.0 g/kg蛋白酶水平下，FBW、AWG、WG%和SGR均在1.0 g/kg益生菌时最高，但与2.0 g/kg组差异不显著；更高益生菌水平（3.0–4.0 g/kg）反而导致生长指标下降。基于WG%的折线回归分析估计，0.5 g/kg蛋白酶条件下的最优益生菌添加量为1.69 g/kg，1.0 g/kg蛋白酶条件下为1.39 g/kg。存活率（SR）在各处理间无显著差异。

3.2 体成分分析

益生菌和蛋白酶的单独或联合添加对丝尾鳠的水分（74.97%–75.82%）、粗蛋白（16.89%–17.75%）、粗脂肪（3.66%–4.11%）和灰分（2.29%–3.23%）含量均无显著影响（p > 0.05）。

3.3 肠道消化酶活性

益生菌和蛋白酶及其交互作用显著影响了肠道淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活性（p < 0.05）。在0.5 g/kg蛋白酶水平下，三种酶活性均随益生菌添加量增加而升高，在4.0 g/kg时达最高值，但2.0、3.0和4.0 g/kg组间无显著差异。在1.0 g/kg蛋白酶水平下，最高酶活性出现在1.0 g/kg益生菌组（淀粉酶1.53 U/mg蛋白、蛋白酶8.56 U/mg蛋白、脂肪酶2.68 U/mg蛋白），2.0 g/kg组与之相当，更高益生菌水平则导致酶活性下降。

3.4 抗氧化酶活性

益生菌和蛋白酶及其交互作用显著影响了超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性和丙二醛（MDA）水平（p < 0.05）。在0.5 g/kg蛋白酶水平下，SOD、CAT和GPx活性随益生菌添加量增加而升高，2.0、3.0和4.0 g/kg组间无显著差异，最高值出现在4.0 g/kg（SOD 5.05 U/mg蛋白、CAT 79.42 U/mg蛋白、GPx 93.55 μU/mg蛋白）。在1.0 g/kg蛋白酶水平下，最高酶活性出现在1.0 g/kg益生菌组（SOD 5.23 U/mg蛋白、CAT 79.49 U/mg蛋白、GPx 94.34 μU/mg蛋白），随后在高益生菌水平下下降。MDA水平呈现相反趋势：在0.5 g/kg蛋白酶下从3.56降至2.53 mg/g蛋白，在1.0 g/kg蛋白酶下于1.0–2.0 g/kg益生菌时最低（2.42–2.45 mg/g蛋白）。

3.5 丝尾鳠的血象

在0.5 g/kg蛋白酶水平下，红细胞计数（RBC）、血红蛋白（Hb）和血细胞比容（HCT）在2.0 g/kg益生菌时达较高水平，虽4.0 g/kg时均值最高，但2.0、3.0和4.0 g/kg组间差异不显著。在1.0 g/kg蛋白酶水平下，RBC和Hb在1.0 g/kg益生菌时最高，HCT在2.0 g/kg时最高。白细胞（WBC）计数方面，0.5 g/kg蛋白酶下最低值出现在2.0 g/kg益生菌（5.42×10³ μL^-1），1.0 g/kg蛋白酶下最低值出现在1.0 g/kg益生菌（5.34×10³ μL^-1）。蛋白酶对WBC的主效应不显著（p = 0.902），但益生菌及其交互效应显著（p < 0.001）。

3.6 血清免疫学和生化参数

在0.5 g/kg蛋白酶水平下，碱性磷酸酶（ALP）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）活性随益生菌添加量增加至2.0 g/kg时降至最低，之后趋于稳定，2.0、3.0和4.0 g/kg组间无显著差异。在1.0 g/kg蛋白酶水平下，最低酶活性出现在1.0 g/kg益生菌（ALP 28.27 U/L、ALT 79.05 U/L、AST 14.54 U/L），ALT和AST在2.0 g/kg时与1.0 g/kg无显著差异，更高益生菌水平则使酶活性回升。益生菌主效应及其与蛋白酶的交互效应对三项生化指标均显著（p < 0.001），而蛋白酶单独效应不显著（p > 0.05）。免疫指标方面，溶菌酶（Lyz）活性和免疫球蛋白M（IgM）浓度在两种蛋白酶水平下均随益生菌添加显著升高，主效应和交互效应均显著（p < 0.001）。在0.5 g/kg蛋白酶下，最高Lyz活性（65.19 U/mL）出现在4.0 g/kg益生菌，但与2.0和3.0 g/kg组无显著差异；IgM从对照组的3.18 mg/mL升至2.0 g/kg时的5.81 mg/mL，之后随益生菌增加而下降。

讨论与结论

本研究表明，益生菌和外源蛋白酶联合添加可通过多种机制协同改善丝尾鳠的生长性能和健康状况。益生菌通过定植胃肠道、平衡肠道菌群、抑制病原微生物、分泌消化酶和有益代谢产物，提高了饲料利用率和养分吸收效率。外源蛋白酶则通过水解植物蛋白中的大分子蛋白质和抗营养因子，增加了氨基酸的生物可利用性。两者的交互作用在较低蛋白酶水平（0.5 g/kg）下表现出更宽的益生菌有效范围（2.0–4.0 g/kg），而在较高蛋白酶水平（1.0 g/kg）下，最优益生菌添加量降低至1.0–2.0 g/kg，过量添加反而导致生长性能下降，这可能与肠道微生物群落失衡或能量代谢负担增加有关。消化酶活性的提高反映了益生菌和蛋白酶对肠道环境的积极调控，促进了内源性消化酶的分泌。抗氧化酶活性的增强和MDA水平的降低表明两者联用可有效缓解氧化应激，这得益于益生菌产生的抗氧化代谢物（如谷胱甘肽、胞外多糖等）以及蛋白酶改善蛋白质消化率从而减少肠道损伤的双重保护作用。血液学参数中RBC、Hb和HCT的升高提示鱼体携氧能力和生理状态改善，而WBC的降低则反映了炎症反应的减轻和免疫稳态的建立。血清肝酶（ALP、ALT、AST）活性的降低证实了益生菌的肝脏保护功能，可能与稳定细胞膜、减少组织损伤和促进蛋白质合成有关。免疫指标（Lyz和IgM）的提升表明先天性和体液免疫防御能力得到增强，这有助于提高鱼体抗病力。

结论：膳食中添加益生菌和外源蛋白酶可增强丝尾鳠的生长和整体健康状况。基于WG%的折线回归分析估算的最优添加量为：0.5 g/kg蛋白酶条件下益生菌1.69 g/kg，1.0 g/kg蛋白酶条件下益生菌1.39 g/kg，表明最优益生菌添加量取决于饲料蛋白酶水平。这些发现凸显了益生菌和外源蛋白酶作为丝尾鳠饲料功能性添加剂的潜力。本研究也存在一定局限性，例如缺乏真正意义上的对照组，且生理生化指标仅在单一时间点进行评估。未来研究应在多个时间点进行动态监测，并借助转录组学、蛋白质组学等分子手段深入探究其对肠道黏膜屏障功能和肠道菌群组成的影响机制，同时开展攻毒试验以验证其在实际养殖中对疾病抵抗力和存活率的提升效果。