日粮中添加枸杞嫩茎叶对育肥滩羊瘤胃细菌群落的影响及其与发酵和生长性状的关联

《Animals》：Effects of Dietary Wolfberry Sprout Stems and Leaves on the Rumen Bacterial Community of Fattening Tan Sheep and Its Association with Fermentation and Growth Traits

　　

枸杞（Lycium barbarum）芽苗在宁夏被大规模采收，残留的嫩茎叶构成了大量但基本未被利用的副产品。本试验旨在研究日粮中添加不同比例的枸杞（Lycium barbarum）嫩茎叶（WSSLs）对育肥滩羊瘤胃发酵和瘤胃细菌群落的影响，并揭示瘤胃细菌与发酵和生长性状之间的关系。研究人员选取48只体重相近（(22.75±0.52) kg）、健康的3月龄断奶滩羊公羔，随机分为4组，每组12只；对照组（G0）饲喂基础日粮，而G4、G8和G12组分别饲喂用WSSLs替代4%、8%和12%玉米秸秆的基础日粮。适应期为10天，试验期为60天。试验结束时，每组屠宰6只羊（共24只），收集瘤胃内容物用于发酵参数测定，并在Illumina NovaSeq平台上对细菌16S rRNA基因的V3-V4区域进行测序。各组间的瘤胃pH值、氨态氮（NH3-N）和微生物粗蛋白（MCP）无显著差异（p > 0.05），而总挥发性脂肪酸（VFA）浓度（30.15-56.27 mmol/L；p = 0.025）、乙酸（p = 0.032）和丁酸（p = 0.010）存在差异；这些VFA差异主要由对照组的高值和变异性驱动，且未呈现剂量反应关系。G8组的平均日增重高于G0和G4组（p = 0.010），宰前活重和胴体重随日粮WSSL水平的增加而增加（分别为p = 0.011和p = 0.013）。共鉴定出17个门和210个属，其中拟杆菌门（Bacteroidota）和厚壁菌门（Bacillota）占主导地位；随着WSSL水平的增加，拟杆菌门的相对丰度下降，而厚壁菌门的相对丰度趋于上升，Xylanibacter是最丰富的属（15.85-18.18%）。α多样性指数在各组间无显著差异（p > 0.05），基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）显示分离程度有限（Adonis R2 = 0.157, p = 0.002）。九个属显示出名义上的组间变异（未校正p < 0.05）；然而，在对所有检测的210个属进行Benjamini-Hochberg FDR校正后，没有一个属保持显著（所有q = 1.00）。Howardella与乙酸、丙酸、丁酸和总VFA呈负相关（p < 0.05），U29-B03与宰前活重和胴体重呈正相关（p < 0.05），克里斯滕森菌科（Christensenellaceae）的细菌与丙酸、丁酸和总VFA呈正相关（p < 0.05）；所有这些关联在FDR校正后均不显著。日粮中添加4-12%的WSSLs不会抑制生长性能，也不会在多检验校正后显著改变任何单个分类群的丰度；它会适度改变瘤胃细菌群落的组成，并且WSSLs可以作为育肥滩羊的一种非常规饲料资源，在4-12%的添加水平下安全使用。

一、研究背景与目的

瘤胃是反刍动物独特的厌氧发酵器官，其内密集且复杂的微生物群落能够降解宿主无法消化的纤维物质和非蛋白氮，并将其转化为挥发性脂肪酸（VFAs）和微生物蛋白，为宿主提供约70%的能量和大部分可利用氮。全球范围的瘤胃微生物群调查显示，日粮组成是决定群落结构的最强因素。因此，通过营养手段直接调控瘤胃微生物群是提高饲料效率和动物生产性能的重要策略。

枸杞（Lycium barbarum L.）是宁夏的特色作物，种植面积约35万亩。每年修剪和采收芽苗会产生大量的嫩茎、叶和枝条（约2×10⁶吨），其中大部分长期被丢弃或焚烧。枸杞嫩茎叶富含多糖、黄酮类、多酚类、类胡萝卜素和甜菜碱，具有抗氧化、抗炎和免疫调节活性。已有研究表明，枸杞副产品可改善羊的生长性能、屠宰性能和肉品质，并调节瘤胃微生物群。然而，枸杞嫩茎叶（WSSLs）——即采收食用芽苗后留下的嫩组织——对育肥滩羊瘤胃细菌群落的影响，以及细菌变化与发酵和生长性状之间的联系，此前尚未见报道。本研究基于研究人员先前发现WSSLs能改善滩羊生长性能的结果，利用16S rRNA基因测序结合瘤胃发酵参数测定，表征了瘤胃细菌群落对递增WSSL水平的响应，并通过斯皮尔曼（Spearman）相关性分析识别与发酵和生长性状相关的菌属，旨在为WSSLs的增值化饲料利用及滩羊瘤胃营养调控提供理论依据。

二、关键技术方法

1. 1.
   实验设计与动物管理：采用单因子完全随机设计，于宁夏农垦牛羊肉食品有限公司暖泉羊场进行。选用48只体重相近（(22.75±0.52) kg）的健康3月龄断奶滩羊公羔，随机分为4组（G0、G4、G8、G12），每组12只。对照组（G0）饲喂基础日粮，处理组分别用WSSLs替代基础日粮中4%、8%和12%的玉米秸秆。适应期10天，正式试验期60天。试验结束时，每组选取6只接近组平均体重的羊（共24只）进行屠宰并采集瘤胃液。
2. 2.
   瘤胃发酵参数测定：使用便携式pH计现场测定pH值；采用苯酚-次氯酸盐比色法测定氨态氮（NH₃-N）；采用Lowry法（福林-酚试剂）测定微生物粗蛋白（MCP）；使用气相色谱法（Agilent 7890A）测定挥发性脂肪酸（VFAs）。
3. 3.
   16S rRNA基因测序与分析：采用CTAB/SDS法提取总微生物DNA，扩增16S rRNA基因的V3-V4高变区，在Illumina NovaSeq平台（PE250）上进行测序。使用QIIME 2（版本2024）处理原始读数，DADA2（版本2024）解析扩增子序列变体（ASVs），并使用Silva 138数据库进行物种注释。
4. 4.
   功能预测与统计分析：使用PICRUSt2（版本2.2.0）预测瘤胃细菌群落的代谢功能，并注释到KEGG、COG和MetaCyc数据库。采用单因素方差分析（ANOVA）检验各组间发酵性状、生长屠宰性状和细菌相对丰度的差异，并对多重比较结果进行Benjamini-Hochberg FDR校正。β多样性通过基于Bray-Curtis距离的PCoA评估，组间差异由Adonis检验。菌属与发酵及生长性状的关系通过Spearman秩相关分析进行评估。

三、研究结果

3.1 瘤胃发酵参数

各组间瘤胃pH值（6.58-6.77）、NH₃-N和MCP均无显著差异（p > 0.05），表明4-12%的WSSL添加未破坏瘤胃酸碱平衡和氮代谢平衡。总VFA浓度（p = 0.025）、乙酸（p = 0.032）、丁酸（p = 0.010）和戊酸（p = 0.039）在组间存在统计学差异，但这些差异主要由对照组的高值和高度变异性驱动，并未呈现一致的剂量反应关系。经Welch异方差ANOVA验证后，仅总VFA仍显著（p = 0.033），而乙酸、丁酸和戊酸不再显著。因此，这些VFA差异需谨慎解读。

3.2 生长性能与屠宰性状

G8组的平均日增重显著高于G0和G4组（p = 0.010）。宰前活重和胴体重随日粮WSSL水平的增加而显著增加（分别为p = 0.011和p = 0.013），而GR值（第12和13肋骨间组织厚度）无显著差异（p = 0.493）。结果表明，用4-12%的WSSL替代玉米秸秆不会抑制生长性能，且在8%添加水平下有改善趋势。

3.3 瘤胃细菌α多样性

ACE、Chao1、Shannon和Simpson等α多样性指数在各组间均无显著差异（p > 0.05），表明WSSLs未显著改变瘤胃微生物群的物种丰富度和均匀度。

3.4 瘤胃细菌群落组成

在门水平，共检出17个门，拟杆菌门（Bacteroidota）（44.41-51.38%）和厚壁菌门（Bacillota）（40.17-44.16%）为主导菌门。拟杆菌门的相对丰度随WSSL水平增加而降低，而厚壁菌门则趋于增加。在属水平，共鉴定出210个属，Xylanibacter是最丰富的属（15.85-18.18%），其丰度随WSSL水平增加而下降。

3.5 瘤胃细菌β多样性

基于Bray-Curtis距离的PCoA显示，PCoA1和PCoA2分别解释了8.43%和7.79%的群落变异。Adonis检验表明组间群落结构存在显著的整体差异（R² = 0.157, p = 0.002），但样本点重叠较多，组间分离有限。

3.6 组间差异菌属

单因素ANOVA识别出9个具有名义上组间差异（未校正p < 0.05）的菌属，如UCG-004在G4组丰度最高，Syntrophococcus随WSSL水平增加总体下降。然而，在对所有210个属进行Benjamini-Hochberg FDR校正后，没有一个属保持显著（所有q = 1.00）。

3.7 差异菌属与发酵及生长屠宰性状的关联

Spearman相关分析显示了一些名义上的关联：Howardella与乙酸、丙酸、丁酸和总VFA呈负相关；UCG-004与pH呈正相关，与乙酸、丙酸和总VFA呈负相关；norank_f__Christensenellaceae与丙酸、丁酸和总VFA呈正相关。对于生长性状，U29-B03与宰前活重和胴体重呈正相关，Syntrophococcus与宰前活重呈负相关。但在对所有90个菌属-性状测试进行FDR校正后，所有这些关联均不再显著（所有q ≥ 0.134）。

3.8 预测功能谱

PICRUSt2功能预测显示，各组间KEGG一级功能类别的相对丰度无显著差异（p = 0.15-0.93），代谢相关功能约占78%。尽管群落组成发生变化，但预测的功能谱基本保持稳定，体现了瘤胃微生物组的功能冗余性。

四、讨论与结论

讨论总结：

研究发现，添加4-12%的WSSLs未引起瘤胃pH异常，表明其对瘤胃稳态无不良影响。总VFA的组间差异主要由对照组的个体变异导致，而非WSSLs的剂量效应，这与群落组成变化未伴随整体发酵强度一致变化的观察相符。α多样性的稳定性符合成年反刍动物核心瘤胃微生物组高度稳定和功能冗余的特点。β多样性分析虽显示统计显著，但实际分离有限，表明WSSLs对整体群落结构的影响温和。在门水平，拟杆菌门丰度下降而厚壁菌门上升，反映了发酵底物的转变。在属水平，Xylanibacter的下降可能与其降解的木聚糖和半纤维素在WSSLs中含量较低有关。关于菌属-性状关联，虽然一些菌属（如Howardella、Christensenellaceae、U29-B03）显示出名义上的相关性，但均未通过多重检验校正，因此这些关联是探索性的，不能作为WSSLs通过这些特定菌群促进生长的证据。预测功能的稳定性进一步证实了瘤胃微生物组的功能冗余性，支持了WSSLs作为安全非常规粗饲料的潜力。研究人员也指出，由于日粮配方的调整，严格来说比较的是四种营养均衡的日粮，而非仅WSSLs不同的日粮。

研究结论翻译：

在本研究条件下，日粮中添加4-12%的WSSLs不影响育肥滩羊的瘤胃pH值、NH₃-N、MCP或细菌α多样性，而各组间的总VFA浓度存在差异。瘤胃细菌群落在单个分类群丰度上仅表现出有限的、非显著的变动：在检测的210个属中，有9个显示出名义上的组间变异（最低未校正p = 0.011），但在Benjamini-Hochberg FDR校正后均不显著（所有q = 1.00）。这些名义菌属与发酵或生长屠宰性状之间的探索性相关性在FDR校正后同样不显著（所有q ≥ 0.134），仅作为名义结果报告。β多样性分析揭示了统计学上显著但生物学上轻微的重组（Adonis R² = 0.157, p = 0.002），组间重叠较大，且预测的功能谱基本保持不变，这反映了瘤胃微生物组的功能冗余性。总体而言，WSSLs可作为育肥滩羊的一种非常规饲料资源，而不会对其瘤胃pH值、氮代谢或生长性能产生不利影响；其添加仅边际性地重塑了群落，并保留了核心瘤胃功能，支持其在适当添加水平下的安全性。