ω-转氨酶的挖掘与工程化及其在生物催化合成（R）-3-氨基丁醇中的应用

《Biochemical Engineering Journal》：Mining and Engineering of ω-Transaminases for the Biocatalytic Synthesis of ( R)-3-Aminobutanol

　　

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  表征了一种用于合成（R）-3-氨基丁醇的（R）-选择性ω-转氨酶（NsTA）。
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  活性位点和环区工程改造增强了NsTA的催化性能。
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  G136F/H62T突变体的比活力比野生型高3.25倍。
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  结构分析揭示了底物通道和酶稳定性的改善。
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  实现了（R）-3-氨基丁醇的高效合成，对映体过量值（ee）>99%。

引言

手性胺是药物合成、精细化学品生产和不对称催化中不可或缺的构建模块[1], [2], [3]。由于对映异构体在生物系统中常表现出不同的药理活性、代谢途径和毒理学特征，获得光学纯的手性胺对于提高疗效和减少不良反应至关重要[4], [5], [6], [7]。因此，光学纯手性胺已被广泛用作许多药物合成的关键中间体，包括卡巴拉汀（抗阿尔茨海默病）[8]、奥利司他（抗肥胖）[9]和西那卡塞（拟钙剂）[10]。一个标志性的例子是西格列汀的生物催化合成，其中来源于ATA-117的（R）-选择性转氨酶经过多轮定向进化，以工业规模提供了该抗糖尿病药物的手性胺前体[11]。

（R）-3-氨基丁醇是一种有价值的手性氨基醇，是合成几种重要药物的关键中间体[12]，包括用于治疗失眠的食欲素受体拮抗剂苏沃雷生和HIV整合酶抑制剂多替拉韦[13], [14]。它还被用于制备4-甲基环磷酰胺和青霉烯类抗生素。因此，开发高效且可持续的光学纯（R）-3-氨基丁醇合成路线引起了广泛的研究兴趣。目前，（R）-3-氨基丁醇的生产主要依赖于化学合成和生物催化方法[15], [16]。传统化学方法，包括不对称诱导、手性拆分和化学还原，通常伴随着苛刻的反应条件、昂贵或有毒催化剂的使用以及可持续性受限等问题[17], [18], [19]。相比之下，生物催化作为一种有吸引力的替代方案受到了广泛关注，具有优异的立体选择性、高催化效率和环境友好的反应条件[20], [21], [22]。Sun等人通过定向进化改造了来源于嗜冷芽孢杆菌（Sporosarcina psychrophila）的胺脱氢酶（SpAmDH），用于1-羟基-2-丁酮的不对称还原胺化[23]。此外，ω-转氨酶（ω-TAs）因其能够利用廉价的氨基供体（如异丙胺）直接催化前手性酮的不对称胺化，而无需外部烟酰胺辅因子再生系统，引起了越来越多的关注[24], [25]。

ω-TAs是属于折叠IV家族的磷酸吡哆醛（PLP）依赖性酶，催化氨基供体和羰基受体之间氨基的可逆转移[26], [27], [28]。由于其广泛的底物谱、优异的对映选择性和温和的操作条件，ω-TAs已成为不对称合成光学纯胺类最重要的生物催化剂之一[29], [30], [31], [32]。特别是，（R）-选择性ω-TAs能够以优异的立体选择性直接将4-羟基-2-丁酮转化为（R）-3-氨基丁醇，使其成为工业生物制造中极具前景的候选酶[33]。因此，大量研究致力于（R）-ω-TAs的鉴定和工程改造。例如，Zheng等人从放线菌属（Actinobacteria sp.）中鉴定出一种（R）-ω-TA，即AsTA，该酶以异丙胺为氨基供体高效催化4-羟基-2-丁酮的一步胺化，实现了99.9%的ee值和29.6 g/L的最大产物产量[34]。Yu等人进一步报道了来自红杆菌属（Rhodobacter sp. 140 A）的RbTA，并通过结构分析阐明了底物识别的分子基础[35]。最近，Liu等人通过结合虚拟突变和底物通道工程改造了高活性的（R）-ω-TA，即MITA。采用底物分批补料和空气吹扫工艺，在100 mM底物浓度下实现了93%的转化率，ee>99.9%[36]。然而，尽管一些天然存在的ω-TAs表现出优异的催化性能，但其活性、稳定性和底物耐受性高度依赖于酶和反应体系，可能并不总能满足特定工业应用的要求[37], [38], [39]。为解决这些局限性，蛋白质工程策略，如理性设计、定向进化、底物通道工程和环区工程，已被广泛探索[40], [41], [42], [43], [44]。在这些方法中，柔性环区的工程改造引起了越来越多的关注，因为环动力学已知对底物识别、催化效率和蛋白质稳定性有重要影响[45], [46], [47]。

基于这些考虑，本研究鉴定了一种ω-TA，随后应用蛋白质工程在野生型酶的活性位点口袋和环区引入突变，从而增强其催化活性和热稳定性。然后系统优化反应条件以进一步提高催化效率，使得在高底物浓度下高效合成（R）-3-氨基丁醇成为可能。总体而言，本研究旨在通过工程改造的ω-TA建立一种高效且可持续的（R）-3-氨基丁醇生物催化合成工艺，为手性药物中间体的生产提供绿色实用的策略，并促进可持续工业制造的发展。

章节摘要

材料

4-羟基-2-丁酮、5'-磷酸吡哆醛、异丙胺以及（R）-和（S）-3-氨基-1-丁醇标准品购自阿拉丁生化科技股份有限公司（中国上海）。所有化学品和试剂均购自阿拉丁，化学品来自可靠的供应商，纯度至少为试剂级，未经进一步纯化直接使用。

在密码子优化后合成了NsTA基因，并插入到pET28a（+）载体的Nco限制性位点之间。

（R）-ω-TAs的生物勘探和筛选

使用CD-HIT去除冗余序列，并基于多序列比对消除保守区域存在显著差异的序列后，构建了系统发育树。为增加系统发育多样性并避免主要从单一进化谱系中选择候选酶，选择了三个独立的进化分支，并从每个分支中选取一个或两个代表性序列。如图S1所示，代表性序列从以下分支中选取：

结论

总之，我们鉴定了一种属于NsTA的酶，来源于诺卡氏菌属（Nocardioides sp.），并通过同源建模和分子对接进行了结构指导的工程改造。对接分析表明，位于底物结合口袋和相邻环区的残基H62和G136分别在底物识别和构象动力学中发挥关键作用。通过定点突变和组合筛选，构建了双突变体G136F/H62T。该

CRediT作者贡献声明

Sifan Cui: 可视化、验证、调查、数据管理。 Li Ma: 监督、资源、资金获取、概念化。 Yunting Liu: 项目管理、方法学、调查、资金获取。 Ying He: 监督、资源、资金获取、概念化。 Liya Zhou: 写作—审阅与编辑、验证、方法学、调查、正式分析、数据管理、概念化。 Yuxi Xie: 写作—初稿、可视化、验证、

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何已知的竞争性经济利益或个人关系，可能影响本文所报告的工作。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（22308083）、河北省科技计划项目（26242801D和25242801D）、中央引导地方科技发展资金项目（246Z2813G）的资助。

补充材料

补充材料包括表S1–S10和图S1–S3，见补充信息文件。

Liya Zhou|Yuxi Xie|Sifan Cui|Li Ma|Yunting Liu|Ying He