《Biochemical Engineering Journal》：Improving methanol tolerance and utilization of
Saccharomyces cerevisiae via SCRaMbLE and systematic metabolic engineering
编辑推荐：
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通过SCRaMbLE技术，SynV&X的甲醇耐受性得到了显著提升。
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基因组和转录组分析
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通过SCRaMbLE技术，SynV&X的甲醇耐受性得到了显著提升。
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基因组和转录组分析建立了基因型与表型之间的联系。
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删除RAD4基因以及过表达CAR1和SER3基因可以提高甲醇耐受性。
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在耐甲醇菌株SynV&X-18中重构了XuMP代谢途径。
引言
甲醇作为一种广泛可用、价格低廉、易溶于水且能量丰富的化合物，是生物技术过程中的理想C1碳源[1]、[2]。开发以甲醇为营养物质的细胞工厂为利用C1资源提供了有力途径，从而有助于解决全球性的挑战，如可持续能源和环境污染问题[3]、[4]。微生物能够将甲醇转化为多种有价值的产品，包括其他蛋白质[5]、[6]、[7]以及化学品[8]、[9]。尽管前景广阔，但甲醇生物转化的工业性能指标仍远低于实际应用的需求[10]、[11]。这些限制主要源于两个关键问题：首先，甲醇及其代谢中间产物甲醛的细胞毒性会损害细胞生理功能[12]、[13]；其次，微生物对甲醇的天然耐受性较低，限制了细胞生长、代谢流量以及生物合成效率[14]、[15]。为此，研究人员致力于改造模式微生物宿主（如大肠杆菌 [16]、枯草芽孢杆菌 [18]、酿酒酵母、毕赤酵母等耐甲醇酵母株[19]，以克服这些障碍，实现更高效的甲醇基生物进程。
虽然甲醇是一种有前景的碳源，但其固有的毒性常常限制了甲醇营养型微生物的有效利用[20]。因此，提高微生物的甲醇耐受性至关重要，这不仅有助于阐明甲醇毒性的机制，还能指导更强大菌株的工程化设计。这一需求在许多实际应用中尤为突出，因为在这些应用中微生物必须暴露在高浓度甲醇环境中[21]、[22]。例如，生物柴油生产的主要副产品——粗甘油中可能含有大量的甲醇杂质（浓度可高达37.5%（重量百分比）[23]）。虽然可以通过能耗较高的蒸发方法去除甲醇，但如果发酵微生物能够耐受这种浓度，工艺效率将大大提高。同样，随着农业食品废弃物作为替代发酵底物越来越被利用，问题也变得更加突出，因为果胶丰富的废弃物中天然含有甲醇（源于D-半乳糖醛酸单体的酯化反应[24]）。总之，研究和改造高甲醇耐受性的微生物菌株对于推动含甲醇底物的生物转化具有重要意义。
目前，实验室适应性进化是提高甲醇耐受性的主要方法，已应用于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌等微生物；然而，这种方法往往耗时且劳动强度高[25]。相比之下，SCRaMbLE（通过LoxP介导的合成染色体重排和修饰）系统提供了一种快速产生广泛基因多样性并改善复杂表型的有力方法[26]。迄今为止，SCRaMbLE已在多种性状改良中展现出有效性，包括抗药性、环境压力耐受性和有价值化合物的生产[27]。与更耐甲醇的酵母株相比，酿酒酵母具有更优异的遗传操作特性，例如高效的同源重组能力和丰富的分子工具箱，便于复杂的基因组操作[28]。其明确的遗传背景减少了干扰因素，便于与以往研究进行直接比较。此外，染色体重排技术已成功将酿酒酵母改造成合成甲醇营养型生物，展示了其代谢网络的灵活性及其转化一碳底物的潜力。合成菌株SynV&X是在Sc2.0项目中开发的，其中天然染色体V和X被合成染色体（synV和synX）替代。这些合成染色体含有多个loxPsym位点，为SCRaMbLE介导的基因组多样化提供了理想平台。因此，SynV&X的明确遗传背景使其特别适合通过SCRaMbLE研究甲醇耐受性的遗传决定因素[29]。
在本研究中，我们在合成酿酒酵母 SynV&X中应用SCRaMbLE和代谢工程，培育出了具有显著提高甲醇耐受性的菌株SynV&X-18-XuMP。敲除实验证明，删除RAD4基因的菌株比其他菌株具有更高的甲醇耐受性，其OD???值是对照组SynV&X的1.24倍。转录组分析显示，SER3和CAR1基因的上调是提高耐受性的关键因素，分别使相关代谢产物的产量比亲本菌株提高了0.23倍和0.19倍。SER3和CAR1通过调节丝氨酸和精氨酸的代谢影响细胞膜结构和功能，从而增强甲醇耐受性。为进一步验证甲醇耐受性对代谢工程菌株性能的改善效果，我们迅速在SynV&X-18中组装了甲醇同化途径（XuMP）。工程菌株SynV&X-18-XuMP的甲醇利用效率比SynV&X-XuMP高1.73倍。这些结果清楚地表明，提高甲醇耐受性能有效提升合成甲醇利用微生物的甲醇利用效率。
章节摘录
菌株、质粒和培养基
主要使用的酵母菌株是SynV&X，它携带合成染色体V和X；PCR4质粒用于精确控制潜在的基因组重排[30]。细菌培养在Luria-Bertani（LB）培养基中进行，培养基成分（每升）包括10克色氨酸、5克酵母提取物和10克氯化钠，必要时加入15克琼脂。酵母菌株通常在酵母提取物-葡萄糖（YPD）培养基中培养（酵母提取物含量10克/升、蛋白胨含量20克/升）。
SCRaMbLE系统的构建
基于合成酿酒酵母的多染色体SCRaMbLE系统，本研究以SynV&X菌株作为潜在的重排宿主。为了精确控制基因组重排，我们设计了双输入“AND门”开关PCRE4（pGAL1-Cre-EBD-tCYC1）。其活性依赖于β-雌二醇的存在[43]、[44]（图1a）。在这个系统中，只有当存在半乳糖时，pGAL1启动子才会驱动Cre-EBD融合基因的表达。
结论
本研究通过分析酿酒酵母中的合成基因组重排现象研究了甲醇耐受性。在SynV&X菌株中构建了一个潜在的重排系统，并通过“AND门”开关PCRE4进行精确调控，从而获得了遗传稳定的菌株SynV&X-18，在YPD液体培养基（含10%甲醇）中培养72小时后，其甲醇耐受性提高了0.6倍。对甲醇耐受性菌株SynV&X-18的基因组和转录组测序进一步证实了这一结果。
CRediT作者贡献声明
尹秋月：实验研究。 赵梅荣：数据整理。 崔忠新：初稿撰写。 齐海山：审阅与编辑。 张雷：数据可视化。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家重点研发计划（2022YFC2104800）和合成生物学国家重点实验室自主创新基金（HCZC-202604A）的支持。
