豌豆根瘤内生细菌抑制镰刀菌冠根腐病并促进硬粒小麦生长的生物防治潜力

《Biological Control》：Pea root- and nodule-derived endophytic bacteria suppress Fusarium culmorum disease and promote durum wheat growth

　　

豌豆（Pisum sativum L.）根部和根瘤来源的内生细菌可抑制黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）病害并促进硬粒小麦生长。植物持续暴露于生物和非生物胁迫之下，这些胁迫可能限制其生长与生产力。与有益微生物的共生关系可通过涉及植物激素、次级代谢产物及植物防御反应激活的复杂互作，帮助植物应对这些限制因素。其中，内生细菌定殖于植物内部组织而不引起可见病害症状。部分内生菌兼具植物促生细菌（PGPB）功能，可通过增加养分可利用性、产生植物激素以及通过竞争、产生抗菌化合物和挥发性有机化合物（VOC）、分泌水解酶等机制抑制植物病原菌。小麦是摩洛哥的战略性作物，在保障国家粮食安全中发挥重要作用，但其生产受环境胁迫及多种土传病害（尤其是镰刀菌属物种引起的冠根腐病）的制约。黄色镰刀菌是小麦冠根腐病的重要致病菌，常从半干旱环境种植的谷物中分离获得，其持续存在得益于在土壤和受感染作物残体中存活并产生厚垣孢子等抗逆结构的能力。镰刀菌相关冠根腐病的防治通常依赖轮作、残体管理、种子处理、品种选择和化学防治的综合措施，但这些方法可能提供不完全的保护，而重复使用杀菌剂可能产生不利的环境影响并促进抗药性病原群体的选择。利用有益细菌进行生物防治因此代表了一种潜在有价值的补充策略。豆科植物如豌豆可能提供具有潜在有用生物防治和植物促生特性的内生细菌库。尽管已有研究报道沙雷氏菌属（Serratia）和赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus）等属细菌具有生物防治和植物促生活性，但豌豆来源内生菌对硬粒小麦上黄色镰刀菌的潜在防治效果仍未得到充分探索。本研究旨在评估从豌豆植株分离的可培养内生细菌作为黄色镰刀菌潜在拮抗菌和硬粒小麦生长促进菌的能力。研究从摩洛哥凯尼特拉采集的豌豆根和根瘤复合样本中分离获得40株可培养内生细菌，通过直接对峙培养筛选获得3株抑制率超过50%的菌株Y34、K12和Y14，抑制率分别为89.23%、80.31%和66.77%。基于部分16S rRNA基因序列分析，Y14和K12被鉴定为赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus sp.），Y34被鉴定为沙雷氏菌属（Serratia sp.）。三株菌在挥发性化合物介导和细胞游离滤液试验中均表现出间接抗真菌活性，其中K12和Y34的挥发性介导抑制率分别为59.21%和55.89%，显著高于Y14的21.15%；三株菌的细胞游离滤液均完全抑制真菌生长。三株菌均表现出纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶和β-葡聚糖酶活性以及磷酸盐溶解能力和阳性吲哚乙酸（IAA）、氢氰酸（HCN）和氨产生的定性反应。温室试验中，在无病原菌条件下，三株菌均显著提高了硬粒小麦的各项生长指标，其中K12的总长度（91.45 cm）和根长度（40.70 cm）最高；在病原菌接种条件下，Y34、K12和Y14处理的病害发生率分别从病原对照的100%降至35%、25%和20%，对应发病率降低65%、75%和80%。这些发现表明三株菌是具有进一步研究价值的候选菌株，其中Y14和K12在生物防治与植物促生联合应用方面显示出特别前景，但需进行独立温室试验、非灭菌土壤试验、菌株水平分类学鉴定、机制研究和田间验证后方可考虑农业应用，尤其是沙雷氏菌属Y34的生物安全性评估至关重要。

豌豆根瘤内生细菌抑制镰刀菌冠根腐病并促进硬粒小麦生长的研究解读

一、研究背景与科学问题

植物在其生长周期中持续面临生物胁迫（如病原菌侵染）和非生物胁迫（如干旱、养分缺乏）的双重压力，这些胁迫严重制约作物的生长与产量。植物与有益微生物的共生关系可通过复杂的分子互作网络帮助植物缓解这些逆境胁迫，其中内生细菌因其定殖于植物内部组织而不引起可见病害症状的特性，成为生物防治和植物促生研究的重要对象。部分内生细菌兼具植物促生细菌（PGPB）功能，可通过增加养分可利用性、产生植物激素以及通过竞争、抗菌化合物和挥发性有机化合物（VOC）的产生及水解酶的分泌等多种机制抑制植物病原菌。

小麦是摩洛哥的战略性粮食作物，在保障国家粮食安全中具有核心地位。其生产主要依赖雨养条件，因此频繁受到干旱和降水不规律的影响。硬粒小麦（Triticum durum Desf.）在摩洛哥饮食和种植体系中尤为重要，但其生产受到环境胁迫和多种土传病害的制约。小麦冠根腐病与多种土传真菌复合体相关，其中黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）是重要致病菌，在北非受感染麦田中被频繁检出。该病原菌的持续存在得益于其在土壤和受感染作物残体中存活的能力以及产生厚垣孢子等抗逆结构的能力。此外，部分镰刀菌物种还能产生真菌毒素，使其发生既影响作物生产又关乎食品安全。

当前镰刀菌冠根腐病的防治主要依赖轮作、残体管理、种子处理、品种选择和化学防治的综合策略，但这些方法可能提供不完全的保护，而杀菌剂的重复使用可能产生不利环境影响并促进抗药性病原群体的选择。因此，利用有益细菌进行生物防治代表了一种潜在有价值的补充策略。豆科植物如豌豆（Pisum sativum L.）可能提供具有潜在有用生物防治和植物促生特性的内生细菌库。尽管已有研究报道沙雷氏菌属（Serratia）和赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus）等属细菌具有生物防治和植物促生活性，但豌豆来源内生菌对硬粒小麦上黄色镰刀菌的防治效果仍未得到充分探索。本研究旨在填补这一生物学空白，探索豌豆作为多功能内生菌替代来源的可能性，并将这些细菌的抗真菌、酶活和植物促生特性与其在温室条件下保护和促进硬粒小麦生长的能力联系起来。

二、研究设计与技术方法

研究人员于2023年3月从摩洛哥凯尼特拉Hadd Ouled Jelloul的农业田块采集处于结果期的豌豆植株，将5株植株的根部组织合并为一个复合根样本，根瘤合并为一个复合根瘤样本。通过表面消毒、匀浆和系列稀释涂布法在King's B和酵母甘露醇（YEM）培养基上分离获得40株可培养内生细菌。通过直接对峙培养法筛选对黄色镰刀菌具有拮抗活性的菌株，以50%抑制率为筛选阈值。对筛选获得的高活性菌株进行形态学特征观察、革兰氏染色和部分16S rRNA基因测序及系统发育分析。进一步通过挥发性化合物介导试验和细胞游离滤液试验评估间接抗真菌活性，并通过多种琼脂平板法检测纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶等胞外酶活性以及磷酸盐溶解、吲哚乙酸（IAA）产生、氢氰酸（HCN）产生和氨产生等植物促生和生物防治特性。温室试验采用完全随机设计，设置健康对照、病原对照、三株菌单独处理和三株菌与病原菌联合处理共8个处理组，每处理5盆，每盆4株，以盆为实验单元，在40天生长周期结束后评估植株生长指标和病害发生率。

三、研究结果

3.1 菌株分离与初始拮抗筛选

表面消毒有效性对照试验未检测到微生物生长，证实消毒程序有效。从豌豆根和根瘤复合样本中共获得40株可培养内生细菌。直接对峙培养中，各菌株对黄色镰刀菌的抑制率介于8.62%至89.23%之间。仅3株菌超过50%的筛选阈值：Y34抑制率为89.23%，K12为80.31%，Y14为66.77%，对应的真菌菌落直径分别为0.875 cm、1.600 cm和2.700 cm，而细菌-free对照为8.125 cm。其余37株中，14株表现中等活性，16株低活性，7株极低活性。Kruskal-Wallis检验检测到菌株间净真菌生长存在总体差异，Dunn-Bonferroni两两比较显示Y34与Y14之间存在差异。

3.2 直接和间接抗真菌活性

三株菌在直接对峙、挥发性化合物介导和细胞游离滤液三种试验中均表现出对黄色镰刀菌的抑制活性。直接对峙中Y34抑制率最高（89.23%），其次为K12（80.31%）和Y14（66.77%）。挥发性化合物介导试验中，K12和Y34分别产生59.21%和55.89%的抑制率，均显著高于Y14的21.15%。三株菌的细胞游离滤液在所有四个重复平板上均完全抑制真菌生长，对应100%抑制率。

3.3 表型特征

三株菌在菌落形态和革兰氏反应上存在差异。Y14和K12为革兰氏阳性，形成白色至奶油色、半透明、光滑圆形菌落；Y34为革兰氏阴性，形成红色、中等大小、微凸、光滑有光泽的圆形菌落。三株菌均为杆状、能运动，且均能发酵甘露醇。

3.4 16S rRNA基因鉴定

BLASTn分析将Y14和K12归入赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus），Y34归入沙雷氏菌属（Serratia）。由于部分16S rRNA序列无法在种水平上明确区分密切相关的物种，菌株被保守地命名为Lysinibacillus sp. Y14、Lysinibacillus sp. K12和Serratia sp. Y34。最大似然系统发育分析与BLASTn结果一致。

3.5 胞外酶活性和植物促生及生物防治特性

三株菌均表现出纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶和β-葡聚糖酶活性以及磷酸盐溶解能力。Y14的蛋白水解指数最高（3.17），K12的磷酸盐溶解指数最高（3.95）。三株菌均呈过氧化氢酶阳性，并产生阳性定性反应的IAA和氨，HCN评分均为3（中等产生）。

3.6 对小麦的保护和促生效应

在病原菌接种处理中，病害发生率从病原对照的100%降至Y34处理的35%、K12处理的25%和Y14处理的20%，对应发病率降低65%、75%和80%。Dunn-Bonferroni比较显示K12和Y14处理的病害发生率低于病原对照，Y34为中间响应。在无病原菌条件下，三株菌均显著提高了所有测定的生长指标。K12的总长度（91.45 cm）和根长度（40.70 cm）最高，且显著高于Y34和Y14处理。

四、讨论与结论

研究表明豌豆来源的内生细菌Y14、K12和Y34具有互补的抗真菌和植物促生潜力。Y34在直接体外抑制中表现最强，K12在促进小麦生长方面效果最突出，Y14在降低病害发生率方面数值上最优。三株菌通过接触依赖和可扩散或挥发性介导的过程抑制黄色镰刀菌，并表现出多种与生物防治和植物促生相关的功能特性。然而，研究存在若干局限性：复合样本无法评估个体植株间的变异；温室试验仅进行一次，结果应视为初步发现；灭菌基质不能代表农业土壤的复杂性；酶和促生特性测定基于单一培养物的技术重复；部分16S rRNA测序仅支持属水平鉴定。对于沙雷氏菌属Y34，由于该属部分成员是机会性病原菌，需通过全基因组测序和表型安全性测试进行生物安全性评估。总体而言，三株菌被确定为值得进一步研究的候选菌株，其中Y14和K12在生物防治与植物促生联合应用方面显示出特别前景，但需独立温室实验、非灭菌土壤试验、菌株水平分类学鉴定、机制研究和田间验证后方可考虑农业应用。