饥饿状态下的小球藻（Parachlorella kessleri）使用生物基离子液体进行部分去蛋白化：直接接触法与微波辅助提取法的比较研究

《Biomass and Bioenergy》：Partial deproteinization of starved Parachlorella kessleri using bio-based ionic liquids: a comparative study of direct contact and microwave-assisted extraction

　　• 乙酸胆碱的蛋白质提取率最高（可达13.8%）。• 微波辅助提取提高了蛋白质回收率。• 总体蛋白质产率在6.1%至13.8%之间。• 碘化胍最适合碳水化合物的选择性提取。• 质量平衡显示生物质回收率为91.9%–103.5%。**引言**航空业是最难脱碳的行业之一，因此目前正在寻求清洁替代方案以减少碳排放。在此背景下，源自可再生原料的可持续航空燃料（SAFs）作为减少温室气体排放的可行途径，已变得越来越重要[1]。在现有原料中，微藻因其较高的单位面积生产力、能在非耕地上生长以及积累脂质、碳水化合物和蛋白质等富含能量的生物分子的能力，已成为有前景的候选者[2]。在这种综合生物炼制框架内，蛋白质耗尽但保留了大部分脂质、碳水化合物和灰分的固体残渣，拟用于水热液化（HTL），这是将湿微藻生物质转化为液体生物燃料最合适的热化学途径之一。这是因为它避免了高能耗的干燥过程，并能高效转化多种生化组分[3]。然而，微藻的生化组成对生产适用于可持续航空燃料的高品质生物燃料构成了挑战[4]。在HTL过程中，蛋白质热分解会释放出含氮化合物，如胺类、酰胺类、腈类和含氮杂环化合物，严重损害了生物燃料的质量[5]。因此，在HTL转化前降低微藻蛋白质含量的策略变得越来越重要，因为这样做可以同时提高生物燃料质量，并产生具有营养或工业应用价值的增值蛋白质组分[6]。*Parachlorella kessleri*是一种微藻，因其生长健壮、蛋白质含量高以及在不同培养条件下能够积累有价值的生物分子而受到关注[7]、[8]。它是一种单细胞生物，细胞近乎球形，具有厚而坚硬的细胞壁[9]。其高蛋白质含量对生产适用于可持续航空燃料的高品质生物原油构成了重大挑战[1]。此外，当*Parachlorella kessleri*处于营养缺乏条件以增强脂质积累时，该微藻会发生代谢重编程，进一步增强了细胞壁的刚性，阻碍了成分的提取[10]。*Parachlorella kessleri*的卓越抗性归因于其细胞壁，其中含有(1→3)-β-d-葡聚糖和几丁质，而外层纤维层完全由氨基葡萄糖组成[11]。与*Chlorella vulgaris*中存在的葡萄糖-甘露糖细胞壁或*Nannochloropsis gaditana*的无定形纤维素细胞壁相比，这种组成赋予了其卓越的机械和化学抗性[12]。传统的蛋白质提取方法，如微珠研磨、高压均质化和溶剂法，通常伴随着高能耗、环境问题和蛋白质变性[13]。这些局限性促使人们在综合生物炼制框架内探索替代性、更可持续的提取技术。近年来，离子液体（ILs）因其独特的理化性质，包括可忽略的蒸气压、热稳定性、可调极性和强氢键能力，已成为微藻生物分子提取的有前景的替代溶剂[14]、[15]。一些离子液体，特别是胆碱类离子液体，因其与传统有机溶剂相比具有相对较低的毒性和生物可降解性，符合绿色化学原则而受到重视[16]、[17]。然而，应注意并非所有离子液体都具有相同的这些性质，必须针对每个离子液体单独考虑其环境特征。离子液体通过在分子水平上运行的协同机制促进生物分子的提取。在胆碱类离子液体中，胆碱阳离子上的羟基作为氢键供体，而季铵盐则提供对阴离子蛋白质残基的静电稳定作用。对于乙酸胆碱，乙酸根阴离子具有优异的氢键碱性（β = 1.20 vs. Cl? β = 0.83），这可能使其能够与水竞争蛋白质表面的相互作用位点，并可能促进蛋白质解折叠和提取[18]、[19]、[20]。碘化胍中的胍阳离子具有平面Y形几何结构，这可能使其能够同时与相邻多糖链上的多个羟基相互作用，并可能促进碳水化合物的增溶[21]。微波辅助提取（MAE）已被认为是从微藻生物质中提取蛋白质的有效方法，与常规提取方法相比具有多项优势，包括成本更低、反应时间相对较短、能耗更低以及CO?排放更少[22]。微波辐射会诱导局部高温高压梯度，从而增强传质速率并促进细胞壁破裂[23]。微波是否还具有超出快速高效加热之外的特定（非热）效应，仍存在争议[24]。然而，热效应也可能导致高温下蛋白质变性，因此需要优化提取条件[25]、[26]。作为替代方案，直接接触提取代表了一种更温和的方法，消除了微波能量需求，同时可能保持蛋白质结构[27]。在大型藻类中的研究报道，使用基于离子液体的方法并以乙酸胆碱（[Ch][Ac]）作为提取溶剂，蛋白质提取率可达80.4%[28]，但由于细胞壁组成和刚性的差异，直接外推到微藻受到限制。Motlagh等人[29]报道，在直接接触离子液体（DC）提取中使用乙酸胆碱，在40°C下处理30分钟，蛋白质提取率约为*Nannochloropsis oceanica*总蛋白质含量的26%，优于传统方法如索氏提取或超声处理。然而，从饥饿的*Parachlorella kessleri*中回收蛋白质在很大程度上仍未被探索。此外，大多数DC研究集中于用于生物燃料的脂质生产，而对优先考虑蛋白质的生物炼制概念的重视有限[29]。本研究旨在评估使用四种具有不同理化性质的离子液体对饥饿*Parachlorella kessleri*生物质进行脱蛋白的效果：氯化胆碱（[Ch][Cl]）、乙酸胆碱（[Ch][Ac]）、胆碱-尿素（[Ch][U]）和碘化胍（[GI]）。比较了两种提取方法：直接接触（DC）和微波辅助提取（MAE）。除了蛋白质提取效率外，本研究还评估了碳水化合物和脂质的共提取，表征了残余生物质的组成，并评估了脱蛋白生物质作为综合生物炼制框架内水热液化增强原料的适用性。在本研究中，未采用任何先前的机械细胞破碎（如珠磨、高压均质化）。这是一个有意的设计决策，旨在评估离子液体穿透完整细胞壁和增溶生物分子的内在能力，从而将离子液体-生物质相互作用的化学贡献与机械能输入分离开来。虽然机械预处理已知可以提高提取产率，但它们也显著增加了能耗和工艺复杂性[13]。**材料**对于Folch法：氯仿（Sigma-Aldrich，>99%）；甲醇（分析级，Scharlau S.L.，≥99.9%）；无水硫酸钠（Na?SO?，Sigma-Aldrich，>99%）。对于BCA法：Pierce? BCA蛋白质检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国）。对于Dubois法：一水葡萄糖（Sigma-Aldrich，>99%）、苯酚（PanReac AppliChem，结晶，82% w/v）。对于离子液体合成：胆碱氢氧化物（45%水溶液，Fluka）；尿素（CH?N?O，Sigma-Aldrich，≥99.5%），无水乙醇（分析级。**微藻的表征**表2展示了本研究中使用的饥饿*Parachlorella kessleri*微藻的完整生化表征。总固体含量（19.1 ± 0.3% w/w）表明高水分含量（80.9%），这是未经预先冷冻干燥而冷冻储存的新鲜微藻的典型特征。灰分含量相对较低（2.9 ± 0.3% w/w TS），这有利于热化学转化应用，因为它能最大限度地减少无机残留物的积累并降低HTL中结垢的风险。**结论**离子液体类型是影响饥饿*Parachlorella kessleri*蛋白质提取的最显著因素（F?,?? = 42.3；p < 0.001）。乙酸胆碱（[Ch][Ac]）获得了最高产率（MAE条件下为13.75%），超过了氯化胆碱、胆碱尿素和碘化胍。乙酸根阴离子较高的氢键碱性（β = 1.20）可能与此结果有关。然而，离子液体的其他性质，如粘度、极性和pH值，未被评估，且...**CRediT作者贡献声明****Denisse Rivas-Navia:** 写作——审阅与编辑，写作——原稿，验证，方法学，调查，正式分析，数据管理，概念化。**Ariadna Márquez Juan:** 验证，方法学，调查，正式分析。**Jacky Cheikhwafa:** 资源，方法学，数据管理。**Alba Zurita:** 资源，方法学，数据管理。**Esther Torrens:** 资源，项目管理，方法学，资金获取，数据管理。**Christophe Bengoa:** 写作——审阅与...**利益冲突声明**作者声明，他们对本文讨论的任何产品或概念均无商业或专有利益。**致谢**作者感谢AlgoSolis研究与开发设施（www.algosolis.com）提供了饥饿*Parachlorella kessleri*生物质。Denisse Rivas感谢罗维拉·依维尔基里大学提供的Martí Franquès博士前奖学金（2021PMF-PIPF07）。最后，本工作获得了欧盟地平线欧洲研究与创新计划（COCPIT）的资助，资助协议编号为101122101。本工作还由罗维拉·依维尔基里大学共同资助（2022PFR-URV-25）。Denisse Rivas-Navia|Ariadna Márquez Juan|Jacky Cheikhwafa|Alba Zurita|Esther Torrens|Christophe Bengoa