结构指导的苯并[d]噁唑类NAMPT抑制剂优化，用于治疗NAPRT缺陷型癌症

《Bioorganic Chemistry》：Structure-guided optimization of benzo[ d]oxazole-based NAMPT inhibitors against NAPRT-deficient cancers

　　•NAMPT结合位点的结构分析指导了小分子抑制剂的设计。
•连接体修饰确定了[烟酰胺-苄基连接体-苯并[d]噁唑]骨架用于进一步优化。
•苯并[d]噁唑优化使H322抗增殖效力较1a（SW008135）提高了约587倍。
•化合物3o显示出最高的ΔAUC和显著的NAPRT依赖性选择性。
•化合物3o直接抑制NAMPT酶活性，IC50为86.72?±?17.51?nM。
•分子动力学模拟为NAMPT抑制剂的结合行为提供了超越静态对接预测的额外见解。
引言
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）是一种中枢代谢辅因子，在哺乳动物细胞的细胞代谢和信号传导通路中发挥重要作用。与氧化还原活性烟酰胺环相连的腺苷部分是NAD+在进化上保守的结构，这使得可逆氢化物转移反应能够将分解代谢和合成代谢过程与细胞能量状态耦合。通常，NAD+在糖酵解、三羧酸循环和氧化磷酸化中作为氧化还原反应的关键决定因素，维持ATP的产生[1]。
此外，NAD+作为多种消耗NAD+的酶（包括聚（ADP-核糖）聚合酶（PARPs）、去乙酰化酶（sirtuins）和CD38）的关键底物，从而参与DNA修复、染色质重塑、转录调控、钙信号传导和应激适应[52]。为了维持这些过程，哺乳动物细胞持续周转细胞内NAD+库，而不是简单地进行回收，这需要严格调控NAD+生物合成以维持细胞稳态[1]，[3]。
哺乳动物细胞通过不同的生物合成途径维持NAD+库：从膳食色氨酸开始的从头合成途径，从烟酸开始的Preiss–Handler途径，以及利用烟酰胺和烟酰胺核糖苷的补救途径[1]，[4]。在从头合成途径中，色氨酸首先由吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）或色氨酸2,3-双加氧酶（TDO）转化为N-甲酰犬尿氨酸，随后经过几个酶促步骤生成喹啉酸[1]，[5]。之后，喹啉酸由喹啉酸磷酸核糖转移酶（QAPRT）转化为烟酸单核苷酸（NAMN），随后从头合成途径通过共享的下游路线与Preiss–Handler途径汇合[4]，[6]，[7]。Preiss–Handler途径利用烟酸，烟酸被烟酸磷酸核糖转移酶（NAPRT）核糖基化形成NAMN。然后，NAMN被烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶（NMNAT1–3）腺苷酰化生成烟酸腺嘌呤二核苷酸（NAAD），最终由NAD合成酶（NADS）酰胺化生成NAD+[1]，[7]（图1）。
同时，补救途径回收来自NAD+消耗反应的烟酰胺和烟酰胺核糖苷。烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）将烟酰胺转化为烟酰胺单核苷酸（NMN），烟酰胺核糖苷被烟酰胺核糖苷激酶（NRK1/2）磷酸化生成NMN。随后，NMNAT将NMN转化为NAD+，通过补救循环补充细胞NAD+库。这些生物合成途径共同维持哺乳动物细胞中的NAD+稳态[1]，[7]，[8]。
NAD+稳态的破坏与多种病理状况相关，包括衰老、代谢紊乱、神经退行性疾病和癌症[1]，[9]，[10]。快速增殖的癌细胞表现出增强的代谢和基因毒性应激，这增加了通过氧化还原反应和消耗NAD+通路的代谢流量，对NAD+的可用性提出了更大需求。增强的DNA损伤信号传导和染色质重塑进一步参与包括PARPs和去乙酰化酶在内的NAD+依赖性酶，进一步增加转化细胞中的NAD+周转[10]。这种对NAD+的需求增加建立了可被治疗利用的代谢脆弱性[1]，[10]，[11]，[12]。
越来越多的证据表明，癌细胞的NAD+生物合成能力通常通过通路水平上特定酶基因或表观遗传学的扰动而改变[13]，[14]，[15]。特别是，在多种癌症类型中已报道NAPRT的缺失或表观遗传沉默，包括胃癌、结直肠癌、肺癌和脑癌。此类改变损害了Preiss–Handler通路，并限制了烟酸作为NAD+生物合成前体的使用，从而增加了对烟酰胺依赖性NAD+补救的依赖[16]，[17]，[18]，[19]。在这些条件下，烟酰胺补救通路成为NAD+产生的主要方式，使NAMPT成为NAPRT缺陷癌细胞中NAD+稳态的关键调节因子。在表现出代谢活性升高和NAD+持续消耗的癌细胞中，对NAMPT介导再生的依赖使得细胞内NAD+库对NAMPT活性的变化高度敏感。总的来说，这些特征建立了一个机制框架，其中NAMPT在表现出替代NAD+生物合成途径利用受损的癌症中成为一个有吸引力的治疗靶点[11]，[20]。
因此，理解NAMPT功能和配体识别的结构基础对于定义如何从药理学上靶向该酶非常重要。可用的NAMPT结构知识大部分是通过结构引导的抑制剂开发塑造的。早期使用原型抑制剂如FK866（APO866）的晶体学研究通过揭示小分子在二聚体界面保守隧道内的结合（例如，PDB ID: 2GVJ, 2GVG）为NAMPT阻断建立了结构基础[19]，[21]。后续研究表明，化学上不同的骨架可以进入相同的催化环境，如GMX1778（CHS-828）所例证[22]。结构导向的优化也产生了下一代抑制剂，包括GNE-617，其晶体学分析捕捉到了磷酸核糖基化抑制剂-酶加合物复合物（例如，PDB: 4O0Z, 4L4M）[23]。这些晶体学研究共同提供了关于化学上不同的抑制剂如何占据NAMPT结合位点的直接结构观察。
值得注意的是，配体在NAMPT结合位点内的结合并不一定导致酶抑制。尽管结合在NAMPT抑制剂也占据的区域内，但几种小分子已被报道增强NAMPT活性[24]，[25]，[26]，[27]。这些结果表明，单独的结合位点占据不能完全解释配体结合的功能后果，特定的分子相互作用和配体诱导的构象变化是NAMPT调节的重要决定因素[15]，[24]，[25]，[26]，[27]。
总的来说，这些结果支持NAPRT缺陷和NAMPT抑制之间的合成致死关系，其中NAPRT的缺失或抑制限制了通过Preiss–Handler途径的烟酸利用，并增加了对NAMPT介导的NAD+补救的依赖。同时，与不同NAMPT配体相关的不同功能结果强调了识别有利于产生抑制性结合的分子特征的重要性。与不同NAMPT配体相关的不同功能结果强调了理解决定抑制活性的配体-蛋白质相互作用的重要性，为合理设计NAMPT抑制剂提供了结构框架。
部分片段
烟酰胺底物类NAMPT抑制剂的设计
开发新型NAMPT抑制剂需要仔细考虑NAMPT催化腔的独特结构特征，该催化腔可容纳化学上多样的配体，同时对产生抑制性结合有严格要求。为了建立合理的设计策略，我们首先评估了两种代表性NAMPT抑制剂，即FK866[21]和SW008135[16]，两者均被报道具有强效的NAMPT抑制活性，尽管它们具有不同的结构特征。
结论
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）对细胞代谢和维持众多生物学功能至关重要。其生物合成由三个主要途径支持，包括从头合成、Preiss–Handler和补救途径。其中，NAPRT缺陷和NAMPT抑制之间的合成致死关系提供了利用某些癌细胞代谢脆弱性的治疗机会。然而，先前开发的抑制剂的临床局限性...
细胞活力测定和IC50计算
化合物浓度通过连续稀释制备，使用不同的浓度范围用于后续的SAR研究。在初始SAR研究（表1、表2）中评估的化合物使用从最大浓度12.5?μM开始的二倍连续稀释进行测试，而在表3中评估的苯并[d]噁唑衍生物则从最大浓度100?μM开始，以0.5对数浓度间隔进行测试。每个浓度下的细胞活力以溶剂处理的对照为基准进行标准化。
人体研究
本研究在开展研究的地点遵守相关法律、法规框架和指南进行。
根据相关法律和机构指南，不需要伦理委员会批准。由于本研究仅涉及已建立的细胞系，不包括人类参与者、可识别的人类材料或动物实验，因此根据适用的机构指南，不需要伦理委员会批准。
手稿准备过程中生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备本工作期间，作者使用ChatGPT（OpenAI）协助科学写作、语言精炼和手稿编辑。作者根据需要审查和编辑了输出内容，并对发表文章的内容负全部责任。
CRediT作者贡献声明
Yeji Kim：写作–审阅与编辑，写作–初稿，可视化，调查，正式分析，数据管理。Jooyoung Lee：写作–审阅与编辑，调查，数据管理。Hocheol Lim：调查。Myung-Jeom Ryu：调查。Jee Sun Yang：调查，正式分析。Chang-Mok Oh：调查。Chulho Lee：正式分析。Hyun Seok Kim：监督，项目管理，资金获取，概念化。Gyoonhee Han：写作–审阅与编辑。
知情同意和患者详细信息
作者未获得参与者或其法律代表的知情同意。本研究未涉及人类参与者。
未引用参考文献[2]
利益冲突声明
作者声明没有已知的竞争财务利益或个人关系，可能影响本报告中所述工作。
致谢
本研究由韩国政府（科学与信息通信技术部，MSIT）资助的国家研究基金会（NRF）的[生物与医疗技术开发项目]（RS-2023-00222838，RS-2024-00408191和RS-2023-NR076996），以及由韩国健康产业发展研究院（KHIDI）资助的韩国ARPA-H项目（由韩国卫生福利部资助，拨款号：RS-2025-25422732）支持。作者还感谢新药...
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