《Applied Sciences》：Application of Probe Sonication for Defatting and Extraction of Theobromine and Caffeine from Cocoa-Based Samples
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甲基黄嘌呤类（methylxanthines）是天然存在的嘌呤生物碱，广泛存在于可可基产品中。由于此类基质的脂肪含量相对较高且基质复杂，适当的样品前处理是对其进行测定的重要步骤。本研究考察了采用超声探针直接超声作为可可基样品脱脂及甲基黄嘌呤提取替代方法的适用性
甲基黄嘌呤类（methylxanthines）是天然存在的嘌呤生物碱，广泛存在于可可基产品中。由于此类基质的脂肪含量相对较高且基质复杂，适当的样品前处理是对其进行测定的重要步骤。本研究考察了采用超声探针直接超声作为可可基样品脱脂及甲基黄嘌呤提取替代方法的适用性。比较了三种脱脂程序：索氏提取（Soxhlet extraction）、使用超声浴的间接超声辅助提取以及使用探针的直接超声辅助提取。提取脂肪的百分比分别为13.56 ± 0.52%、8.94 ± 1.52%和18.46 ± 2.89%。使用石油醚作为溶剂、单次10 min探针超声处理被证明是可可样品脱脂的一种有前景且省时的替代方法。对于甲基黄嘌呤提取，研究人员对del Rosario Brunetto等人使用的方法进行了改良，将20 min水浴提取替换为10 min直接探针超声。改良后的程序应用于可可粉、可可豆和85%可可巧克力样品。测定的可可碱（theobromine）浓度为15.61 ± 0.24至31.01 ± 0.91 mg/g，咖啡因（caffeine）浓度为1.64 ± 0.05至2.95 ± 0.07 mg/g。所有样品中茶碱（theophylline）浓度均低于定量限（LOQ），因此其结果被认为仅指示其存在而非可靠的定量值。通过加标回收试验估算了脱脂可可粉中可可碱和咖啡因的提取回收率。获得的平均回收率分别为可可碱112.31%和咖啡因109.65%。研究人员使用AGREE和AGREEprep评估了分析程序和样品前处理（包括脱脂步骤）的绿色度，得分分别为0.50和0.53。评估结果表明该过程绿色度仍有进一步改善的可能性。结果表明，超声探针直接超声缩短了脱脂和甲基黄嘌呤提取时间，并表明该方法具有简化复杂可可基样品前处理的潜力。
**研究背景与意义**
甲基黄嘌呤类化合物是天然存在的嘌呤生物碱，主要包括可可碱、咖啡因和茶碱，广泛存在于可可基食品和饮料中。这类化合物对人体健康具有双重影响：一方面可能引起心率变化、血压升高、生育问题及失眠等不良反应；另一方面，在剂量依赖条件下也报道了诸多有益健康效应。可可基产品因脂肪含量较高且基质复杂，其甲基黄嘌呤的测定面临挑战，样品前处理成为减少基质效应、实现可靠提取的关键步骤。对于富脂可可基样品，脱脂步骤通常被纳入前处理流程。索氏提取虽是传统脱脂方法，但耗时长且需要大量有机溶剂。超声辅助提取（UAE）作为替代方法日益受到关注，其中超声浴为间接超声，能量传递效率较低且温度控制困难；而超声探针（直接超声）可将声能直接传递至提取介质中。尽管已有研究将超声探针用于可可基质中甲基黄嘌呤的提取，但脱脂通常单独进行或沿用传统脱脂程序。据研究人员所知，将超声探针同时用于可可基产品脱脂及后续甲基黄嘌呤提取尚未被系统研究。因此，本研究旨在评估超声探针用于可可基样品脱脂及后续甲基黄嘌呤提取的适用性，考察超声时间对两个前处理步骤的影响，并采用AGREE和AGREEprep指标评估改良程序的绿色度。该研究的意义在于探索一种快速、省时的样品前处理替代方案，以简化复杂富脂可可基质的分析流程。
**关键技术方法**
研究人员比较了三种脱脂程序：索氏提取（4 h，石油醚）、超声浴间接超声辅助提取（35 kHz，1.5 h，石油醚）和超声探针直接超声辅助提取（20 kHz，振幅70%，10 min，脉冲3 s/间歇2 s，石油醚），样品与溶剂比均为1:25。甲基黄嘌呤提取方面，以del Rosario Brunetto等人报道的热水提取法（80 °C水浴20 min）为标准方法（SM），将其改良为超声探针直接超声提取10或30 min（AM），其余参数保持一致。甲基黄嘌呤采用高效液相色谱（HPLC）分离，C18柱（4.6 × 250 mm，5 μm），流动相为甲醇/水（20:80，v/v），等度洗脱，流速0.8 mL/min，柱温40 °C，检测波长274 nm，进样量20 μL，总分析时间20 min。样品包括可可粉（克罗地亚）、85%可可巧克力（德国）和烘焙可可豆（墨西哥）。通过加标回收试验评估提取回收率。采用AGREE Version 0.5和AGREEprep软件评估绿色度。统计分析使用JASP 0.98.1，包括Shapiro–Wilk检验、Levene检验、Welch t检验和Welch单因素方差分析（ANOVA）及Games–Howell事后检验。
**研究结果**
**校准曲线**：可可碱、茶碱和咖啡因的保留时间分别为7.8 min、12.7 min和19.5 min。可可碱LOD为2.48 mg/L、LOQ为7.52 mg/L；咖啡因LOD为0.06 mg/L、LOQ为0.17 mg/L；茶碱LOD为0.07 mg/L、LOQ为0.21 mg/L。通过标准溶液校准曲线计算得出，代表仪器检测和定量限。
**脱脂程序比较**：提取方法对提取脂肪百分比有统计学显著影响（Welch ANOVA，p = 0.029）。超声探针获得最高的提取脂肪百分比（18.46 ± 2.89%），显著高于超声浴（8.94 ± 1.52%；p = 0.030），与索氏提取（13.56 ± 0.52%）的差异无统计学显著性（p = 0.169）。超声浴提取脂肪百分比显著低于索氏提取（p = 0.047）。考虑到超声探针仅需10 min，而超声浴需90 min、索氏提取需240 min，结果表明超声探针直接超声是可可样品脱脂的一种有前景且省时的替代方法。与已有超声脱脂程序相比，本方法的关键区别在于使用超声探针而非超声浴。
**甲基黄嘌呤提取**：10 min超声暴露相比30 min产生更高的可可碱和咖啡因提取量（p < 0.001和p = 0.001）。茶碱浓度低于LOQ。与标准方法（SM）相比，使用改良方法（AM）时可可碱和咖啡因的提取量平均增加8%，差异具有统计学显著性（可可碱p = 0.002；咖啡因p = 0.009），支持AM在所研究提取条件下的有效性。茶碱浓度低于LOQ，无法进行可靠定量评估。由于10 min提取时间更短且更适用，后续研究选择10 min AM作为甲基黄嘌呤提取方法。
**脱脂可可粉中甲基黄嘌呤提取回收率评估**：可可碱和咖啡因的平均加标回收率在80–120%范围内，被认为对复杂基质是可接受的。由于回收率试验仅在单一加标水平下使用两个独立制备的样品进行，有限的重复次数和浓度水平无法全面评估回收率，因此所得结果应视为提取过程中甲基黄嘌呤回收率的估计值，而非分析方法完全验证的证据。
**使用AM分析可可基样品**：脱脂样品的测定结果与文献报道一致。色谱图中未观察到干扰或重叠峰，表明所应用的脱脂程序和AM适用于可可基样品中咖啡因和可可碱的测定。样品中甲基黄嘌呤的保留时间与相应标准品一致。比较脱脂与非脱脂样品的结果显示，非脱脂样品中所有可可基样品的分析物浓度均降低，可可碱和咖啡因平均降低13.4%，可可豆样品降低40.3%，85%可可巧克力降低30.3%。这可能部分与脱脂程序减少基质相关干扰有关。
**绿色度评估**：AGREEprep评估显示，含脱脂步骤的程序总体绿色度得分为0.53，不含脱脂步骤为0.78。脱脂过程中废物（4）和集成与自动化（7）方面的不足更为明显。AGREE评估显示整个分析方法的总体绿色度得分为0.50，最大不足在于原位测量（3）、能耗最小化（9）和有毒试剂消除或替代（11）。与已有文献相比，AM的AGREE得分（0.50 vs. 0.55）和AGREEprep得分（0.53 vs. 0.67）略低，但AM包含额外的脱脂步骤，增加了溶剂消耗和废物量。结果表明AM尽管增加了脱脂步骤，仍实现了与已发表方法相当的绿色度，且能在较短时间内高效制备富脂样品。
**讨论与结论**
本研究考察了超声探针直接超声作为可可基样品前处理替代方法的适用性。三种脱脂程序的比较表明，使用石油醚作为溶剂、10 min探针超声处理是可可样品脱脂的一种有前景且省时的替代方法。超声探针直接超声也被应用于甲基黄嘌呤提取，通过改良del Rosario Brunetto等人的热水提取程序，在所测试条件下，改良方法（AM）相比标准方法（SM）产生了统计学显著更高的可可碱和咖啡因测定浓度，同时缩短了提取时间。茶碱在样品中的浓度低于定量限（LOQ），因此所获结果被认为仅指示其存在而非可靠的定量结果。使用超声探针直接超声进行脱脂及后续甲基黄嘌呤提取表明，该方法具有简化可可基样品制备和缩短前处理时间的可能性。AGREE和AGREEprep软件的评估提供了所考察程序绿色度的信息，并识别了可进一步改善的方面，但所列得分不代表方法环境影响的全面评估。总之，所得结果表明超声探针直接超声是复杂可可基样品前处理的一种有前景的方法，但仍需进一步研究以确定其更广泛的适用性。
