《Heliyon》：A machine learning-based method toward the prognostic analysis of CD38 with a pathomics model in cutaneous melanoma
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引言：CD38在肿瘤演化中具有重要作用，尤其在皮肤黑色素瘤（CM）中。本研究旨在评估CD38对CM患者的预后价值，并提出一种基于HE染色的病理组学（pathomics）模型用于预测其表达。方法
引言：CD38在肿瘤演化中具有重要作用，尤其在皮肤黑色素瘤（CM）中。本研究旨在评估CD38对CM患者的预后价值，并提出一种基于HE染色的病理组学（pathomics）模型用于预测其表达。方法：从TCGA数据库获取377例具有转录组数据的CM患者和302例具有苏木精-伊红（HE）染色图像的个体，用于预后分析和病理组学特征提取。采用一种全新的机器学习方法，即梯度提升机（GBM）算法，构建病理组学模型以检测CD38表达，并辅以广义线性模型（GLM）和随机森林（RF）分析。随后，检测通路富集分析、免疫相关基因和免疫细胞浸润，以确定病理组学评分（pathomics score）的潜在内在机制。结果：CD38表达在肿瘤样本中显著高于正常样本，且与多种临床变量（包括肿瘤部位、黑色素瘤Clark分级、黑色素瘤溃疡和样本类型）呈统计学相关。值得注意的是，CD38水平升高与良好的总生存期（OS）相关。此外，在亚组分析中，较高的CD38被确定为黑色素瘤Clark分级I/II/III、放疗NO和转移性黑色素瘤患者OS的重要有利预后因素。新建立的病理组学模型成功预测了CD38表达，性能优异，并显示出高病理组学评分与改善的OS之间的稳固关系。同时，高病理组学评分与年龄≥60岁、男性和转移性黑色素瘤亚组中死亡风险降低相对应。此外，病理组学评分参与皮肤黑色素瘤中的特定标志、免疫相关特征和免疫细胞浸润，如自然杀伤细胞介导的细胞毒性（NATURAL_KILL_CELL_MEDIATED_CYTOTOXICITY）、KRAS信号上调（KRAS SIGNALING UP）、PDCD1、BTLA、CD86、CD80和巨噬细胞M1浸润。结论：研究结果表明，CD38和生成的病理组学评分有望作为CM患者OS的预后指标。
一、研究背景：皮肤黑色素瘤（cutaneous melanoma，CM）是皮肤的主要恶性肿瘤，全球发病率呈上升趋势，每年导致超过58000例死亡。其患病率和死亡率因早期检测的可及性而在全球差异很大。目前，大多数既往研究集中于实验室特征、基因组测序数据和临床病理指标对CM患者预后预测和危险因素评估的可靠性。临床上，创新治疗方案的持续应用改善了患者结局，但对于一旦进展即可立即危及生命的CM，由于设备和技术限制，几乎没有将病理图像整合到基因组图谱中以精确评估肿瘤生物学的工作。近年来，越来越多的研究指出机器学习方法在基于病理学知识和相关遗传信息预测患者预后方面的重要性。因此，该技术的实施为识别更有价值的证据以提高CM患者生存率提供了潜在途径。聚类分化抗原38（cluster of differentiation 38，CD38）编码一种非谱系限制的II型跨膜糖蛋白酶，不仅调节细胞迁移和信号转导，还作为胸腺细胞和活化T细胞的标志物影响细胞生长和免疫功能。既往研究表明CD38在多种肿瘤中发挥促肿瘤和预后作用，包括结直肠癌、头颈癌、前列腺癌、卵巢癌、急性淋巴细胞白血病和多发性骨髓瘤等。此外，CD38介导的免疫通过诱导T细胞分化和消除肿瘤免疫微环境中的调节性T细胞（Tregs）来实现。在CM中，CD38与免疫治疗疗效和生存分析呈强关联。因此，CD38可能是CM的合理预后生物标志物。病理组学（pathomics）是一个成熟的融合人工智能（AI）和病理成像的研究领域。通过高通量获取定量图像特征，病理组学可作为黑色素瘤管理的替代方法。此外，既往研究强调了病理组学在评估肿瘤异质性和微环境方面的重要性，这可能为分子诊断、预后和治疗预测提供线索。鉴于目前基于病理组学对CM进行精确预后预测的研究很少，更不用说引入相关基因组信息，本研究设计了一种独特的病理组学模型，利用HE切片研究CM中CD38表达及其与临床预后的关系，同时进行生物信息学分析以探索所设计病理组学评分的分子基础。
二、研究方法：研究人员从TCGA数据库整理并下载了377例具有临床和转录组特征的CM病例，其中302例具有高质量HE图像。排除标准包括：初诊非CM、无生存数据或生存期少于30天、病理分期未知、无RNA-seq数据、图像质量差等。CD38表达数据来自TCGA和GTEx数据库，经Toil流程标准化后转换为log2(TPM+1)，采用Wilcoxon秩和检验比较肿瘤与正常样本间差异表达。使用R包“survminer”确定CD38最佳截断值1.2221，将患者分为CD38低表达和高表达组。采用Spearman相关系数评估CD38与临床变量的关系，单因素和多因素Cox回归检验CD38在各亚组中的预后影响。病理图像以SVS格式在20X或40X放大倍数下采集，采用OTSU算法提取HE切片区域，20X图像分割为512×512像素子图并上采样至1024×1024像素，40X图像分割为1024×1024像素子图。经病理学家审核排除质量缺陷图像后，每张HE切片随机选取10个子图用于病理组学分析。应用PyRadiomics包归一化子图并提取93个原始特征，包括一阶和二阶特征，以及LoG、Wavelet、SquareRoot、Square、Exponential、Logarithm、LBP2D和Gradient等高阶特征。数据集以7:3比例随机分为训练集和验证集，经z-score标准化后进行特征选择：剔除零方差特征，去除相关系数>0.9的冗余特征，应用mRMRe程序的递归特征消除（RFE）和最大相关最小冗余（mRMR）算法获取最优特征子集。基于选定特征构建梯度提升机（GBM）模型预测CD38表达，并进行交叉验证。同时构建GLM和RF模型验证可信度。绘制ROC曲线、PR曲线、校准曲线和决策曲线分析（DCA）评估模型性能。计算预测模型概率即病理组学评分（PS），以0.4256为截断值将患者分为高PS组（n=148）和低PS组（n=154），采用Kaplan-Meier曲线和log-rank检验评估PS与临床预后的关系，单因素和多因素Cox回归评估PS和临床特征对OS的影响。将切片分为低PS和高PS组后进行差异基因分析，识别富集的KEGG和Hallmark基因集，采用Wilcoxon秩和检验探索37个免疫相关基因在两组间的表达，将RNA-seq数据矩阵上传至CIBERSORTx数据库量化免疫细胞浸润，并从TCGA-CM转录组图谱获取免疫表型评分（IPS）和免疫检查点抑制剂（ICIs）数据。统计分析通过R程序（版本4.1.0）和SPSS（版本24.0）完成，P值<0.05视为统计学显著。
三、研究结果：
患者基本特征：CD38截断值为1.2221，377例CM样本分为低表达组（n=216）和高表达组（n=161）。除年龄（P=0.396）、性别（P=0.141）、病理分期（P=0.093）、Breslow深度（P=0.199）和放疗（P=0.216）外，两组间肿瘤部位（P<0.001）、黑色素瘤Clark分级（P=0.003）、黑色素瘤溃疡（P=0.004）和样本类型（P<0.001）具有统计学显著性。
CD38表达与生存分析：CD38在肿瘤组织中显著高于正常组织（P<0.001）。Kaplan-Meier曲线显示CD38升高为有利OS的预后标志物（P<0.001）。同样，年龄（P=0.022）、黑色素瘤Clark分级（P=0.007）、黑色素瘤溃疡（P<0.001）、Breslow深度（P<0.001）、病理分期（P<0.001）、肿瘤部位（P<0.001）和样本类型（P=0.001）与预后呈明显关联。
患者预后统计因素：单因素Cox回归显示高CD38表达为OS的有利预后关联（HR=0.44，95%CI [0.322-0.603]，P<0.001），肿瘤部位（HR=0.508，95%CI [0.364-0.708]，P<0.001）、放疗（HR=0.304，95%CI [0.142-0.648]，P=0.002）和样本类型（HR=0.455，95%CI [0.28-0.739]，P=0.001）亦为有利因素。年龄（HR=1.425，P=0.023）、病理分期（HR=1.773，P<0.001）、Breslow深度（HR=1.868，P<0.001）、黑色素瘤Clark分级（HR=1.807，P=0.002）和黑色素瘤溃疡（HR=1.938，P<0.001）与OS相关。多因素Cox回归表明CD38（HR=0.496，95%CI [0.354-0.695]，P<0.001）、病理分期（HR=1.819，P<0.001）和放疗（HR=0.346，P=0.007）为CM预后的潜在独立预后因素。
亚组评估与交互分析：CD38在年龄、性别、病理分期、肿瘤部位和Breslow深度亚组中显示有利预后关联（HR<1），无显著交互作用。CD38在黑色素瘤Clark分级I/II/III（HR=0.36，P=0.003）、黑色素瘤溃疡NO（HR=0.51，P=0.009）、放疗NO（HR=0.451，P<0.001）和转移性黑色素瘤（HR=0.442，P<0.001）亚组中为有利预后因素。
病理组学特征提取：CM组织病理图像经预处理、分割和特征提取后随机分为训练集（212例）和验证集（90例），两组临床变量无统计学差异。每例HE切片获取465个病理组学特征，经mRMR算法筛选前30个代表性特征，再经RFE确定5个最优特征（wavelet_LL_firstorder_Median、wavelet_LL_ngtdm_Complexity、original_gldm_SmallDependenceLowGrayLevelEmphasis、wavelet_LH_glcm_Imc2、wavelet_HH_firstorder_Skewness）。
病理组学模型构建与预测性能：GBM算法构建的病理组学模型在训练集PR曲线AUC为0.824，验证集为0.748；ROC曲线训练集AUC为0.839，验证集为0.789。Hosmer-Lemeshow拟合优度检验校准曲线表明预测高基因表达与实际值之间预测能力相似（P>0.05），DCA曲线显示模型具有较高临床应用度。GLM分析ROC曲线训练集AUC为0.697，验证集为0.784；RF方法训练集AUC为0.783，验证集为0.759。总体而言，病理组学模型对CD38表达提供了满意预测。
病理组学评分特征：PS在训练集和验证集中CD38低表达和高表达组间差异显著，表明PS与CD38水平正相关。除肿瘤部位（P<0.001）、黑色素瘤溃疡（P=0.001）、放疗（P=0.011）和样本类型（P<0.001）外，低PS组和高PS组间临床特征分布无统计学差异。KM曲线分析证明PS与预后明显关联，高PS组中位OS为108.6个月，低PS组中位OS为58.9个月（P<0.001）。单因素Cox回归显示PS（HR=0.54，P<0.001）、肿瘤部位（HR=0.518，P<0.001）、放疗（HR=0.305，P=0.005）和样本类型（HR=0.419，P=0.002）为OS有利预后因素，年龄（HR=1.483，P=0.025）、病理分期（HR=1.774，P=0.001）、Breslow深度（HR=1.732，P=0.004）、黑色素瘤Clark分级（HR=1.742，P=0.012）和黑色素瘤溃疡（HR=2.014，P<0.001）为不利预后因素。多因素调整后，PS（HR=0.67，P=0.032）、病理分期（HR=1.652，P=0.012）和放疗（HR=0.367，P=0.019）仍为OS的统计学独立预后因素。亚组分析中PS为有利预后因素，如年龄≥60（HR=0.407，P<0.001）、男性（HR=0.496，P<0.001）、肿瘤部位其他（HR=0.605，P=0.014）和转移性（HR=0.579，P=0.003）。
通路富集、免疫基因表达、免疫细胞浸润和IPS分析：KEGG条目中，两个PS组差异表达基因富集于多个免疫相关通路如自然杀伤细胞介导的细胞毒性、T细胞受体信号通路、B细胞受体信号通路等。Hallmark集中，差异表达基因富集于KRAS信号上调、凋亡、IL6_JAK_STAT3信号等通路。免疫基因、免疫细胞浸润与PS间观察到正相关，包括PDCD1、BTLA、CD86、CD80、巨噬细胞M1、T细胞CD8、静息NK细胞和活化NK细胞。高PS组中IPS-PD1/PD-L1阻断剂、IPS-CTLA4和PD1/PD-L1阻断剂明显上调。这些发现表明PS与CM免疫相关特征之间存在内在关联。
四、讨论与结论：CM作为一种侵袭性癌，进展迅速且预后不良，预测后续状态对改善患者总生存至关重要。本研究提供了系统证据表明CD38的转录改变似乎是CM预后中的强大调节因子。特别值得注意的是，这是首次创造性地采用病理组学这一全新技术预测预后因子CD38表达，暗示其在CM中的预后价值。此外，评估了其他临床变量包括黑色素瘤Clark分级、黑色素瘤溃疡、Breslow深度、病理分期、肿瘤部位和样本类型的预后价值。重要的是，组织病理成像数据以令人印象深刻的准确性验证了病理组学模型的预后优越性，同时阐明了PS与免疫特征之间的潜在关系。研究人员建议病理组学衍生的CD38轴可能成为未来预测CM携带者总生存的有前景的方法。鉴于CM的不良结局，建立评估预后的生物标志物的兴趣日益增加。既往已提出多种合适候选者，如临床特征、循环肿瘤DNA（ctDNA）、肿瘤出芽、活检方法、Breslow厚度、肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）和基因组改变。本研究发现年龄、黑色素瘤Clark分级、黑色素瘤溃疡、Breslow深度、病理分期、肿瘤部位和样本类型为CM的统计预后因素。然而，这些因素的预后潜力仍不明确，更不用说提高预测性能的先天关联。据报道，CD38作为一种不可或缺的II型跨膜糖蛋白，参与多种肿瘤的癌变过程。最新工作建立了基于CT成像的非侵入性放射组学模型评估上皮性卵巢癌中CD38表达，其生存价值通过交叉验证评估。同样，CD38在黑色素瘤和正常组织中也通过RNA测序分析发现差异表达。与之一致，本研究利用TCGA数据库强调了CD38在CM中的功能。经严格筛选，纳入377例进行转录表达和生存评估，分析阐明CD38水平在CM病变中统计学升高，并与患者良好预后密切相关。然而，当前文献几乎没有关注转录CD38变化在利用某些有说服力的生物信息学技术筛选CM患者中的重要性。近年来，趋同证据将组织病理成像数据概念引入癌症诊断、治疗和预后评估领域，特别是随着AI算法的实施将HE切片和基因组信息整合用于患者管理。Boland及其同事开发了一种基于病理组学的方法整合免疫组化数据和CD8+ T细胞空间分布以预测转移性黑色素瘤对BRAF抑制剂的反应。此外，Li等人通过人工神经网络（ANNs）和一系列差异基因提出了独特的病理组学特征，预后预测的AUC值为0.97，损失值为0.2088。特别是，由于AI和组织病理模式在过去几十年中不断演变，将高通量技术与某些病理特征结合预测CM的发生和进展是一个热点。因此，值得注意的是，研究人员基于HE区域使用mRMR和RFE算法从5个最优图像特征创建了一个全新的病理组学模型评估CD38含量。因此，绘制PR、ROC、校准和DCA曲线以证实所建立模型在交叉验证集中的优越性能，表明其区分CD38的有说服力的能力。有趣的是，本研究进一步检查了病理组学评分（PS）对CM患者OS的影响，结果表明高PS与更好的预后相关，与先前研究指示PS在不同癌症中的预后价值一致。同时，调整多个临床变量后PS与OS的关系仍具有统计学意义，突出了PS在CM中的独立预后意义。同样，亚组分析证明了年龄、性别、肿瘤部位、样本类型与PS和预后之间的显著交互作用。研究人员还探索了PS在CM中的潜在生物学行为，富集分析揭示PS组差异基因与免疫微环境显著相关，包括免疫相关通路、免疫基因、免疫细胞浸润和对ICIs的免疫反应，所有这些都参与CM发展并代表治疗途径。据研究人员所知，这是首次采用病理组学分析CM中预后因子CD38的研究，性能令人印象深刻。然而，本研究仍存在一定局限性：所有数据均来自在线公开数据库，导致若干差异，可能需要收集更多病例以提高模型可靠性；本研究的回顾性性质限制了建立CD38水平、PS与患者结局之间因果关系的能力。因此，需要更大或外部验证队列的前瞻性研究来验证研究发现并证明CD38和PS作为CM预后指标的临床效用。此外，鉴于免疫相关分析（如免疫基因表达、免疫细胞浸润和IPS评估）的探索性性质且未进行多重检验校正，结果应被视为假设生成性的，需要在独立队列中进一步验证。尽管如此，研究结论为：CD38水平升高和较高PS与CM患者良好生存相关，CD38和PS可能作为独立预后指标并在未来临床应用中指导个性化治疗策略。
