结构多样的7-苯基噻吩并[3,2-d]嘧啶作为多靶点抗增殖剂对分子特征不同的乳腺癌细胞系：设计、合成、生物学评价及分子对接

《Bioorganic Chemistry》：Structurally diverse 7-phenylthieno[3,2- d]pyrimidines as multitarget antiproliferative agents across molecularly distinct breast cancer cell lines: design, synthesis, biological evaluation, and molecular docking

　　•开发了新型噻吩并[3,2-d]嘧啶类化合物作为多靶点抗癌药物。
•在MCF-7、BT-474、HCC1937、MDA-MB-231和MCF-10 A细胞中进行了活性评估。
•化合物17显示出广谱细胞毒性活性（IC50 = 0.62–7.12 μM；SI = 10.75–123.45）。
•12a、17抑制EGFR；12b、12c调节ARO/ERα；分子对接支持其与活性位点的结合。
•先导化合物触发细胞周期阻滞、caspase-9激活和细胞凋亡。

引言

乳腺癌（BC）仍是全球女性中最常诊断的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的主要原因之一[1]。它是一种生物学异质性疾病，其治疗反应受雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）表达的强烈影响。主要临床分组包括激素受体阳性、HER2扩增型和三阴性肿瘤；然而，在每个类别内部仍存在显著的分子和细胞多样性，尤其是在三阴性乳腺癌（TNBC）中[2]、[3]。这种异质性，加上治疗压力下的克隆演化，导致了原发性和获得性耐药，并支持在生物学上不同的乳腺癌模型中评估新型小分子抑制剂，而非仅在单一细胞背景下进行评估。

ER信号传导是大多数激素反应性乳腺癌的主要生长驱动因素，而芳香化酶（ARO）催化雌激素生物合成的最后一步，因此提供了既定的治疗靶点[4]、[5]、[6]。尽管内分泌治疗具有临床价值，但耐药性经常通过ER依赖性和ER非依赖性机制产生，包括与晚期雌激素受体阳性（ER+）乳腺癌标准激素治疗耐药相关的雌激素受体1（ESR1）改变、细胞周期控制变化以及替代性生长因子通路的激活[4]、[7]。特别是，通过EGFR/HER家族成员的信号传导可以参与PI3K/AKT/mTOR和RAS/RAF/MEK/ERK级联反应，促进不依赖配体的ER活性，并在内分泌治疗期间维持细胞存活[4]、[7]、[8]、[9]。实验证据还表明，细胞质ERα与EGFR/HER2信号传导之间的串扰可能有助于曲妥珠单抗耐药，为同时干扰雌激素依赖性和生长因子依赖性信号传导提供了依据[8]。

噻吩并[3,2-d]嘧啶环系统为这种多靶点策略提供了有吸引力的药物化学平台。其稠合的、富氮杂芳环骨架可以支持ATP结合激酶结构域内的铰链结合相互作用，而双环核周围的取代基可以伸入相邻的疏水区或溶剂暴露区。重要的是，该骨架已支持口服生物利用的PI3K/mTOR/PIM抑制剂，证明合理的取代可以重新定向靶点谱和细胞反应[10]。最近，噻吩并[3,2-d]嘧啶被开发为双功能PI3Kδ选择性/BET抑制剂，进一步说明了同一稠合系统的适应性[11]。

我们之前报道的噻吩并[3,2-d]嘧啶衍生物在乳腺癌中建立了直接先例。该系列中的几个成员对MCF-7和MDA-MB-231细胞显示出亚微摩尔活性，而选定的化合物抑制EGFR或ARO，激活caspase-9，诱导pre-G1凋亡并引起G2/M细胞周期阻滞[12]。这些发现表明，噻吩并[3,2-d]嘧啶核周围的取代可以在共同核心内产生不同的生物学特征，并提示肼基衍生的连接基为调节效力和机制提供了有用的位点。

独立研究进一步证实了该骨架支持激酶靶向抗癌药物的能力。Cho及其同事将2,7-二取代噻吩并[3,2-d]嘧啶确定为粘着斑激酶和FLT3的双重抑制剂，提供了通往多靶点先导化合物的详细构效关系（SAR）路线[13]。Duan等人随后采用杂交设计策略生成有效且选择性的靶向抗癌抑制剂，将该骨架扩展到DNA损伤反应靶向领域[14]。这些研究支持其作为适应性铰链结合骨架的用途，其选择性可通过合理取代重新定向。该骨架与细胞周期控制的相关性通过最近的CDK7项目变得尤为明显。对噻吩并[3,2-d]嘧啶的结构优化此前获得了7-(二甲基磷酰基)-3-(2-(((3S,5S)-5-氟哌啶-3-基)氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)-1H-吲哚-6-腈盐酸盐，作为一种高选择性CDK7抑制剂，具有有利的激酶选择性和药理特性[15]。此外，后续研究获得了(S)-6′-(2-(哌啶-3-基氨基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-7-基)螺[环丙烷-1,3′-二氢吲哚]-2′-酮盐酸盐，其显示出纳摩尔级CDK7抑制活性，并对MDA-MB-453乳腺癌细胞具有显著活性[16]。这一观察结果独立地将该特定骨架与乳腺癌细胞模型以及能够干扰转录调控和细胞周期进程的机制联系起来。其他报道拓宽了机制图谱。噻吩并[3,2-d]嘧啶衍生物已通过综合合成、生物学评估和分子建模作为ATR/PIKK家族抑制剂进行研究[17]。最近，骨架变形产生了选择性JAK1抑制剂，可抑制STAT3磷酸化，减少集落形成，并在癌细胞中诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞[18]。一项2025年的骨架跳跃研究进一步考察了噻吩并[3,2-d]嘧啶类似物的抗增殖潜力和计算行为[19]。总的来说，这些研究表明，该稠合核心可以容纳不同的靶点谱，同时反复收敛于抑制增殖和激活程序性细胞死亡。噻吩并[3,2-d]嘧啶类抗癌药物的实例如图1所示。噻吩并[3,2-d]嘧啶骨架以蓝色突出显示[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]。

本研究通过更广泛地多样化4-肼基和4-苯胺基部分，扩展了我们先前以C4为中心的7-苯基噻吩并[3,2-d]嘧啶骨架研究计划。共同的4-肼基前体被扩展为酰化肼衍生物、腙类、含吡唑类似物和稠合的三唑并嘧啶系统，而平行的4-苯胺基路线引入了查尔酮和缩氨基硫脲连接基。这种设计使得能够在保留7-苯基取代稠合核心的同时，系统探索C4周围的位阻需求、构象限制、芳香取代和氢键能力。除了新合成的衍生物外，我们组先前报道的化合物12a和12b[12]作为比较对照纳入。该组合集在四个分子学上不同的乳腺癌模型中进行了评估：激素反应性MCF-7、ER阳性/HER2扩增型BT-474、BRCA1缺陷基底样HCC1937和间充质样三阴性MDA-MB-231细胞[20]、[21]、[22]。还测定了对非致瘤性MCF-10 A乳腺上皮细胞的细胞毒性，以评估癌细胞选择性。选定的活性化合物被检测对EGFR和ARO的抑制、竞争性ERα结合以及激动剂和拮抗剂报告模式中的功能性ERα调节。使用caspase-9定量、DNA含量分析和Annexin V-FITC/碘化丙啶染色来研究内在细胞凋亡和细胞周期效应。与先前研究相比，本研究旨在将生物学覆盖范围扩展到MCF-7和MDA-MB-231细胞之外，包括ER阳性/HER2扩增型BT-474和BRCA1缺陷型HCC1937模型。它还评估了对非致瘤性MCF-10 A细胞的细胞毒性，并结合了ERα竞争性结合和功能性报告基因测定。因此，本研究提供了更广泛的亚型覆盖、直接评估癌细胞选择性和扩展的靶点表征，而非假定普遍提高抗增殖效力。此外，还进行了分子对接，以提供配体-靶点相互作用的定性模型，并支持构效关系（SARs）的解释。总之，这种亚型解析的评估旨在识别结合抗增殖、内分泌相关和促凋亡活性的噻吩并[3,2-d]嘧啶先导化合物。

章节片段

设计策略

乳腺癌在分子水平上是异质性的，疾病进展和获得性耐药都可能受到ERα、EGFR和ARO依赖性雌激素生物合成之间串扰的支持[9]。这种相互关联的生物学为开发能够调节多种乳腺癌相关通路的结构适应性药物提供了依据。因此，本设计被视为药物化学优化计划，而非单一靶点系列的扩展。骨架选择受以下因素指导

结论

一组结构多样的新合成7-苯基噻吩并[3,2-d]嘧啶衍生物，连同先前报道的对应物12a和12b，在分子学上不同的乳腺癌细胞系中进行了评估。本研究通过更广泛的亚型覆盖、直接评估癌细胞选择性和实验性ERα结合及功能性测定，扩展了噻吩并嘧啶骨架的生物学范围。生物学结果表明清晰的结构和

一般信息

所有试剂和溶剂均购自商业供应商，除非另有说明，否则无需进一步纯化即可使用。熔点使用Stuart SMP10数字熔点仪在开口毛细管中测定，未校正。红外（IR）光谱使用Agilent Cary 630 FTIR分光光度计通过衰减全反射（ATR）记录，以波数（ν cm?1）报告。1H和质子去耦13C NMR谱在Bruker DRX上记录

稿件准备过程中生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备本工作期间，作者使用ChatGPT（OpenAI）来改善稿件的可读性和语言。使用该工具后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对已发表文章的内容承担全部责任。

CRediT作者贡献声明

Samir M.Y. Sedra：写作——初稿，可视化，软件，资源，方法学，调查，正式分析，数据管理，概念化。Heba Abdelrasheed Allam：写作——审阅与编辑，验证，监督，方法学，正式分析，概念化。Tarek M. Okda：写作——审阅与编辑，验证，方法学，调查，正式分析。Kamilia M. Amin：写作——审阅与编辑，验证，监督，方法学，概念化。Omaima M.

知情同意和患者详细信息

作者未获得参与者或其法定代表的知情同意。作者未获得参与者或其法定代表的知情同意。本研究使用从细胞库/供应商处获得的已建立的人类细胞系。未招募人类参与者，也未直接从个体收集样本用于本研究。因此，从参与者处获得书面或口头知情同意不适用于本研究。

人体研究

本研究

资金

本研究未获得公共、商业或非营利部门资助机构的任何特定资助。

利益冲突声明

作者声明，他们没有任何已知的竞争经济利益或个人关系可能影响本论文中报告的工作。

致谢

作者感谢埃及VACSERA确认诊断部门负责人Essam Rashwan博士进行蛋白质印迹分析。

Samir M.Y. Sedra|Heba Abdelrasheed Allam|Tarek M. Okda|Kamilia M. Amin|Omaima M. AboulWafa