高温与低氧对奇努克鲑（*Oncorhynchus tshawytscha*）皮肤的影响——组织学与基因表达研究

《Fishes》：Effects of Increased Temperature and Lower Oxygen on Skin of Chinook Salmon (Oncorhynchus tshawytscha)–Histology and Gene Expression

　　

水温升高及伴随的氧浓度下降是开放网箱水产养殖面临的挑战之一。皮肤是鱼类与外部环境之间的屏障之一，对鱼类健康至关重要。本研究旨在探究暴露于高温（19–20 °C）与低氧（5.8–7.3 mg L^?1）环境对奇努克鲑皮肤健康的影响。在为期66–71天的实验暴露后，计算了个体鱼的生长情况，并将鱼皮肤样本用于组织学和基因表达分析。暴露于高温/低氧条件下的奇努克鲑平均表皮厚度由47.75 μm（SD 8.47，n = 13）降至41.48 μm（SD 10.60，n = 60）。然而，该差异仅在次要的Welch's t检验中具有显著性（p = 0.031），而主要的双因素方差分析未达显著水平（p = 0.060）。皮肤黏液细胞密度未受处理的显著影响。经Benjamini–Hochberg错误发现率校正后，il1β和hsp70的下调与高温/低氧暴露相关。研究结果表明，非生物因素（高温与低氧联合）对网箱养殖奇努克鲑的皮肤健康具有不利影响。

研究背景方面，海产品在人类营养中具有重要意义，鲑鱼养殖是发达国家海产品消费的主要贡献者之一。奇努克鲑（*Oncorhynchus tshawytscha*）因其较高脂肪含量带来的风味而具有较高价值。然而，生态系统变化包括气候变化和沿海水域变暖，是影响海产品供应与消费的关键驱动因素。全球变暖导致水温升高，通常伴随氧浓度下降，受影响水域涵盖全球海水养殖区域。在新西兰，与海洋热浪相关的高水温已对海水养殖和自然系统造成严重影响。夏季水温超过17.0–18.0 °C持续时间较长时，养殖奇努克鲑受到负面影响，表现为死亡率和皮肤病变增加。已有研究表明，缺氧可改变大西洋鲑（*Salmo salar*）对高温的生理和免疫相关反应，但仅有少数实验研究探讨了长期暴露于较高温度和较低氧对鱼类皮肤健康的影响。奇努克鲑在海水养成中皮肤病变发生率增加与较高水温相关，已对新西兰产业造成不利影响。因此，亟需确定长期暴露于高温和较低氧水平对网箱养殖鲑科鱼类皮肤健康的影响。本研究旨在评估长期（66–71天）暴露于高温和低氧联合条件对奇努克鲑皮肤的影响，假设长期暴露会改变皮肤健康，表现为表皮厚度、黏液细胞密度以及免疫、黏蛋白和应激相关基因表达的变化。

研究人员开展了为期66–71天的实验暴露研究，将全雌奇努克鲑暴露于模拟新西兰鲑鱼养殖区夏季条件的高温（19–20 °C）和低氧（5.8–7.3 mg L^?1）环境中，对照组维持于17 °C和8 mg L^?1溶解氧。实验结束后，测量个体生长情况，采集皮肤样本进行组织学和基因表达分析。研究得出以下结论：高温/低氧暴露组平均表皮厚度较对照组降低13%；皮肤黏液细胞密度未受显著影响；经FDR校正后，il1β和hsp70转录本丰度显著下调。研究意义在于，结果表明即使温度小幅升高并伴随较低氧水平，也可能影响全雌奇努克鲑的皮肤健康，使其易于发生皮肤病变，建议在夏季水温较低的区域养殖全雌奇努克鲑以降低皮肤病变风险。

关键技术方法方面，研究人员利用已描述实验中的样本，该实验经Nelson Marlborough Institute of Technology动物伦理委员会批准（AEC 2018 CAW01）。实验鱼为商业来源的全雌奇努克鲑，标记后置于循环水养殖系统（RAS）中，盐度18–20 ppt、温度15 °C，经驯化后用于实验。实验使用三个海水RAS，每个系统含4或5个8000 L水箱，水温由热泵控制，溶解氧通过调节补充氧气注入控制，每15分钟记录一次。对照组鱼置于一个RAS的两个水箱中，处理组鱼置于另外两个RAS的十个水箱中。处理组水温经12天以每天0.25 °C升至20 °C，溶解氧同时降至5.8–6.3 mg L^?1。因死亡率增加及动物福利考虑，暴露6周后温度降至19.5 °C、溶解氧升至6.5–6.7 mg L^?1；第8周后温度降至19 °C、溶解氧升至7.0–7.3 mg L^?1。暴露期间对照组死亡率为4.5%（2/44），高温/低氧组为21.1%（60/285）。实验结束时用100 ppm AQUI-S?安乐死鱼，测量体重和长度后，从背鳍下方左侧背区采集两个相邻皮肤样本，分别用于组织学和基因表达分析。组织学方面，皮肤样本经10%缓冲福尔马林固定、石蜡包埋、4 μm切片，采用Alcian Blue/Periodic Acid-Schiff（AB/PAS）pH 2.5染色，使用Leica DM 1000显微镜和Leica LAS EZ软件每个体鱼拍摄5张显微图像，通过Fiji软件Cell Counter插件计数阳性染色皮肤黏液细胞，计算黏液细胞密度（每10⁴ μm²表皮平均黏液细胞数），并使用InteredgeDistance宏测量表皮厚度（每鱼5次测量）。基因表达方面，取100 mg皮肤样本在RNAzol RT中匀浆提取总RNA，使用Invitrogen? Qubit? 4荧光计测定RNA浓度，使用iScript? cDNA合成试剂盒（含DNase处理步骤）以500 ng RNA合成cDNA。采用qPCR检测免疫、结构和应激相关基因表达，目标基因包括hsp70、cox6b1、tnfα、il1β、scdf1、muc5ac、muc2和col3。qPCR反应体系含SsoAdvanced? Universal SYBR? Green Supermix，在CFX96?实时PCR检测系统上进行，采用touch-down qPCR方案，每反应设技术重复，每板设无模板对照（NTC），未检测到污染，熔解曲线分析评估扩增特异性，使用LinRegPCR软件（版本2020.2）通过线性窗口法确定各样本扩增效率。基因表达分析使用55个生物学样本（11尾对照鱼和44尾高温/低氧处理鱼），采用无参考基因方法和MCMC.qpcr包（R版本4.2.1）分析，基因表达数据以后验平均log2转录本丰度及95%可信区间报告，采用Benjamini–Hochberg错误发现率校正。统计分析使用R版本4.2.1，Shapiro–Wilk检验评估残差正态性，Levene检验评估方差齐性，采用III型平方和非平衡双因素方差分析检验高温/低氧处理和生长状态及其交互作用对皮肤黏液细胞密度和表皮厚度的影响，表皮厚度因生长状态及交互作用不显著，在各处理内合并增重和减重鱼后采用Welch's t检验比较，计算效应量（Cohen's d和Effect size r）。黏液细胞密度因生长状态有显著总体效应，从双因素方差分析解释处理效应。采用Spearman秩相关分析组织学变量与基因表达水平的关系，FDR校正p < 0.05认为显著。

研究结果方面，3.1 表皮厚度与黏液细胞密度：所有采样鱼均无肉眼或显微皮肤病变。皮肤组织学显示表皮层主要由上皮细胞和黏液细胞组成，覆盖于含鳞片和结缔组织的真皮之上。基于AB/PAS染色，多数皮肤黏液细胞含混合黏蛋白，包括中性和酸性黏蛋白。表皮厚度未受高温/低氧暴露显著影响（III型双因素方差分析：F = 3.663，df = 1，69，p = 0.060），鱼生长状态无显著效应（F = 2.343，df = 1，69，p = 0.130），两因素间无显著交互作用（F = 0.780，df = 1，69，p = 0.380）。基于模型的估计边际均值成对比较显示，对照组（p = 0.188）和高温/低氧组（p = 0.445）内增重鱼与减重鱼间均无显著差异。由于生长状态及处理与生长状态交互作用对表皮厚度无显著影响，在各处理内合并增重和减重鱼比较表皮厚度。合并比较中，高温/低氧处理组奇努克鲑平均表皮厚度（41.48 [38.74, 44.21] μm，n = 60）较对照组（47.75 [42.63, 52.86] μm，n = 13）低13%（Welch's t检验：t = 2.308，df = 21.05，p = 0.031）。Cohen's d = 0.654和效应量r = 0.311确认为中等效应量，提示中等重要性，但结果应视为探索性。皮肤黏液细胞密度未受高温/低氧显著影响（III型双因素方差分析：F = 1.092，df = 1，69，p = 0.300），处理与生长状态间无显著交互作用（F = 0.237，df = 1，69，p = 0.628）。然而，鱼生长状态对黏液细胞密度有显著总体效应（F = 4.064，df = 1，69，p = 0.048）。基于模型的估计边际均值成对比较显示，对照组（p = 0.172）和高温/低氧组（p = 0.074）内增重鱼与减重鱼间均无显著差异。由于体重变化类别在暴露后确定，这些比较视为探索性。基于III型双因素方差分析的温度处理效应，对照组（17 °C，n = 13）与高温/低氧处理组（19–20 °C，n = 60）奇努克鲑皮肤黏液细胞密度无显著差异（F = 1.092，df = 1，69，p = 0.300）。3.2 皮肤基因表达：暴露于高温/低氧联合条件与il1β转录本丰度显著降低相关（FDR校正p = 0.0096）。高温/低氧暴露鱼hsp70表达较对照组显著下调（Benjamini–Hochberg FDR校正p = 0.0048），该差异在增重鱼中最为明显，但因体重变化类别在暴露后确定，这些比较视为探索性。高温/低氧联合处理与所选免疫和黏蛋白相关基因转录本丰度降低相关，但经FDR校正后，处理对tnfα、muc2、muc5ac、scdf1、cox6b1或col3表达无显著影响。基于处理×暴露后体重变化组的成对比较，增重的高温/低氧鱼hsp70转录本丰度低于增重对照鱼，而减重的高温/低氧鱼hsp70转录本丰度与对照组无差异。这些处理×暴露后体重变化组差异应谨慎解释，因为体重增减在暴露后确定，代表探索性暴露后变量而非独立分配的实验因素。3.3 组织学变量与基因表达水平的关系：奇努克鲑表皮厚度与皮肤黏液细胞密度呈正相关（rs = 0.50，校正p < 0.001），与il1β（rs = 0.70，校正p < 0.001）、tnfα（rs = 0.68，校正p < 0.001）和muc5ac（rs = 0.55，校正p = 0.02）转录水平呈正相关，与cox6b1转录水平呈负相关（rs = ?0.67，校正p < 0.001）。皮肤黏液细胞密度与il1β（rs = 0.88，校正p < 0.001）、tnfα（rs = 0.83，校正p < 0.001）、hsp70（rs = 0.42，校正p = 0.02）和muc5ac（rs = 0.50，校正p = 0.03）转录水平呈正相关，与cox6b1（rs = ?0.48，校正p = 0.02）和col3（rs = ?0.63，校正p = 0.03）转录水平呈负相关。

讨论部分总结：高温/低氧暴露组奇努克鲑平均表皮厚度降低13%，但暴露与黏液细胞密度无关联。皮肤是第一道防线，表皮厚度降低可能使鱼更易感染。表皮厚度受多种因素影响包括物种和饲料。本研究中表皮厚度降低与大西洋鲑上市后幼鱼高温（16 °C）暴露4周后表皮厚度降低的研究一致。上皮细胞周转率增加导致细胞脱落速率超过细胞替代速率进而导致上皮厚度降低，曾在暴露于酸化水的虹鳟（*Oncorhynchus mykiss*）中描述为应激反应。然而，这与大西洋鲑20 °C暴露4周后表皮增厚和黏液细胞密度增加的结果相反。这些差异可能源于物种特异性差异和不同实验设计，特别是大西洋鲑研究仅短期暴露于高温而未改变溶解氧。本实验持续时间超过两倍，为高温/低氧联合暴露，且对照与处理水箱间温度变化较小，可能导致不同结果。本实验中高温/低氧联合处理与所选免疫和黏蛋白相关基因转录本丰度降低相关，经FDR校正后仅il1β在免疫和黏蛋白相关基因中保持显著。il1β转录本丰度降低提示存活于长期联合暴露的鱼皮肤局部促炎信号减弱，该结果与慢性暴露效应一致，但与急性炎症反应预期不同。奇努克鲑先前研究表明急性热应激不一定增加促炎细胞因子表达，除非结合病原体攻击，且反应因器官和实验背景而异。此外，温度和氧联合应激可改变鲑鱼免疫相关转录反应。因此，观察到的il1β表达降低可能反映长期高温/低氧联合暴露下皮肤炎症信号调控的改变。高温/低氧暴露与全雌奇努克鲑皮肤tnfα、muc2和muc5ac表达无关联。相比之下，2019年2月（17.9 °C）从商业养殖场采样的网箱养殖健康奇努克鲑皮肤muc5ac较2019年5月（14.6 °C）采样上调，提示温度依赖性和可能的季节性效应。养殖场环境温度低于本实验（对照17 °C，高温19–20 °C）。环境或饲养因素可能影响商业养殖场奇努克鲑muc5ac表达，因其非受控实验。大西洋鲑皮肤在操作应激后24小时内muc5ac.2/4和muc5b显著下调，但限制应激14天后上调，被认为由拥挤期间水质变化引起。与本实验类似，大西洋鲑20 °C暴露4周后皮肤muc2或muc5表达无显著变化。幼年奇努克鲑脾、鳃和后肠中促炎细胞因子包括il1β和tnfα在17小时热休克（12 °C至21 °C）后未显著增加，除非热休克后实验性鳗弧菌（*Vibrio anguillarum*）感染。然而，急性热应激（12 °C至26 °C，速率0.23 °C/min）恢复1小时后，二倍体和三倍体奇努克鲑头肾、鳃和心室il1β转录本丰度显著增加。本实验中hsp70下调与高温/低氧暴露相关，这与同一实验中另一亚组奇努克鲑鳃、肝和脾hsp90表达结果一致，后者在高温/低氧暴露鱼中也较低。然而，该研究未检测hsp70表达，本研究未检测hsp90表达。相比之下，2月（较高水温17.9 °C）采样的网箱养殖奇努克鲑皮肤hsp70较5月（较低水温14.6 °C）同一养殖场鱼上调。本实验结果与已发表养殖奇努克鲑结果间的差异可能源于网箱组与本实验组间温度差异、波动（养殖场）与较静态（本实验水箱）温度 regime 以及其他环境变量的潜在差异。热休克基因包括hsp70在大西洋鲑上市后幼鱼16 °C暴露4周后皮肤中较4 °C暴露鱼上调。本结果与大西洋鲑结果间的差异最可能源于测试温度、实验持续时间和物种特异性差异。暖（20 °C）和低氧（70%饱和度）水暴露4周导致大西洋鲑肝脏hsp70上调。急性热应激（12 °C至26 °C）在恢复后1小时测量时显著增加二倍体和三倍体奇努克鲑头肾、鳃和心室hsp70和hsp90表达。此外，本结果与奇努克鲑高温（18 °C）暴露6天后鳃hsp70上调并被建议作为奇努克鲑高温暴露生物标志物的报道相反。然而，各研究使用不同器官，高温暴露持续时间差异进一步导致不同结果。基因表达具有器官特异性，例如寄生纤毛虫多子小瓜虫（*Ichthyophthirius multifiliis*）实验感染诱导虹鳟鳃和皮肤差异基因反应，24个基因中22个在鳃中表达显著高于皮肤。包括皮肤和鳃在内的多器官差异基因表达在暴露于硫化氢的大西洋鲑上市后幼鱼和饲喂不同功能性饲料的大西洋鲑中已有报道。对于高温/低氧联合处理鱼，暴露后体重变化类别与hsp70转录本丰度差异相关。然而，因体重增减在暴露后确定，这些结果应解释为探索性关联而非生长状态导致基因表达差异的证据。增重鱼可能在联合暴露期间生理上与减重鱼不同，但是否反映适应性本研究未直接检验。表皮厚度与黏液细胞密度呈正相关，该关系此前在大西洋鲑中已有报道。奇努克鲑表皮厚度与il1β、tnfα和muc5转录水平正相关，与cox6b1转录水平负相关。皮肤黏液细胞密度与两个促炎细胞因子il1β和tnfα mRNA水平以及muc5和hsp70 mRNA水平正相关，与cox6b1和col3表达负相关。其中部分关系可能为虚假相关，应谨慎解释。本研究中黏液细胞密度采用传统方法测定，目前已有基于立体学的黏膜映射新方法用于量化鱼黏液屏障稳健性。传统黏液细胞定量方法与黏膜映射在短角杜父鱼（*Myoxocephalus scorpius*）鳃和皮肤中比较时多数结果相同。传统方法测定黏液细胞数值密度，黏膜映射测定皮肤黏膜中黏液细胞的体积密度。两种方法各有优劣，使用传统方法使研究人员能够与先前发表结果进行比较。应用两种方法虽有意义，但超出本研究范围和经费。66–71天高温/低氧联合实验暴露未导致奇努克鲑皮肤病变发生，而该物种夏季较高温度养殖时已有皮肤病变报道。这与新西兰养殖奇努克鲑的其他研究一致，提示较高温度虽是风险因素，但皮肤病变病因为细菌性病原体。本研究中观察到的表皮变薄和促炎细胞因子il1β下调在高温/低氧暴露后，将增加鲑鱼对皮肤损伤和感染的易感性，从而证实环境变量作为养殖全雌奇努克鲑皮肤病变发展的风险因素的作用。解释结果时应考虑若干局限性：第一，温度和溶解氧同时操纵，其各自贡献无法区分，所有效应应解释为对高温/低氧联合处理的响应。第二，采样对照鱼来自单一水箱，而高温/低氧鱼来自两个RAS的多个水箱，每个RAS使用多个水箱妨碍了水箱效应与处理效应的统计分离，因此处理与水箱混杂，其效应无法分离，不能确定处理的单独因果效应。第三，暴露结束时仅采样存活鱼，高温/低氧处理死亡率高于对照，存在幸存者偏倚可能，采样鱼可能不代表受联合暴露影响最严重的个体。第四，所有实验鱼均为雌性，结果不应推广至雄性或不加进一步研究推广至混合性别群体。另一局限性是体重增减在暴露期后确定，代表暴露后结果，增重和减重类别可能反映鱼间潜在生理差异、对联合暴露的响应或两者兼有，这些分析应解释为探索性，不应推断体重变化类别独立导致观察到的组织学或基因表达差异。尽管有这些局限性，表皮变薄和促炎细胞因子il1β及hsp70基因下调与奇努克鲑66–71天高温/低氧暴露相关。高温和较低氧浓度及暴露持续时间选择模拟新西兰奇努克鲑养殖区夏季真实条件。实验设计不允许分离高温与低氧效应，因超出研究范围且为有意设计，因自然环境中高温导致溶解氧浓度降低。在可区分高温（20 °C）和低氧（70%饱和度）效应的实验中，缺氧显著促进免疫基因上调，但高温和缺氧效应对大西洋鲑肝脏应激基因表达无叠加作用。

结论部分翻译：总之，全雌奇努克鲑66–71天暴露于高温和较低氧浓度联合条件与存活鱼中促炎细胞因子基因il1β和hsp70基因下调相关。存活于高温/低氧暴露的全雌奇努克鲑平均表皮厚度降低13%。这些结果表明，即使温度小幅升高并伴随较低氧水平，也可能影响全雌奇努克鲑皮肤健康，并使鱼易发生皮肤病变。为降低皮肤病变风险，全雌奇努克鲑应在夏季水温较低的区域养殖。