发现具有潜在抗癌活性的查尔酮-喹唑啉酮杂化物作为BRAF激酶抑制剂：设计、合成、生物学评估和分子建模研究

《Bioorganic Chemistry》：Discovery of chalcone-quinazolinone hybrids as BRAF kinase inhibitors with potential anticancer activity: Design, synthesis, biological evaluation, and molecular modeling studies

　　

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  合成了一系列抗菌酮-喹唑啉酮类化合物4a-l，并证明了它们对BRAF_WT的抑制活性。
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  化合物4d、4f和4l显示出对BRAF_V600E的强抑制作用。
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  化合物4d和4f对HT-29细胞表现出较强的抗癌活性。
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  化合物4f可导致细胞在S期和G2/M期停止分裂，并诱导细胞凋亡。
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  对这些新合成的化合物进行了分子对接研究和分子动力学模拟。

引言

使用小分子或单克隆抗体的分子靶向疗法已被证明是癌症治疗的基本框架[1]。它们主要通过抑制细胞生长、转移和血管生成以及触发细胞凋亡，从而对癌细胞产生选择性的杀伤作用，同时对正常细胞的副作用有限[2]。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路在调节多种细胞过程（包括有丝分裂、细胞分裂和分化）中起着关键作用[3]、[4]。该通路负责将细胞表面受体酪氨酸激酶的信号传递到细胞核，这一过程通过各种蛋白激酶的激活来实现[5]，其中涉及细胞内的MAPK受体；例如快速纤维肉瘤（RAF）、鼠肉瘤（RAS）和细胞外信号调节激酶（ERK）[5]。MAPK信号通路的激活会引发RAS蛋白的活化，进而引发RAF/MEK/ERK级联反应[3]。

BRAF是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，它是通过RAS到MEK的信号转导来传递MAPK活性的RAF亚型之一[6]。BRAF是一个原癌基因，经常在人类癌症中发生突变，在多种类型的癌症中高表达，包括黑色素瘤、结直肠癌和非小细胞肺癌[7]、[8]、[9]、[10]、[11]。BRAF_V600E是最常见的BRAF突变类型[12]，在这种突变中，野生型BRAF（BRAF_WT）第600位的谷氨酸残基被缬氨酸取代，使得激酶在缺乏上游信号的情况下也能持续处于活性状态，从而维持RAF/MEK/ERK（MAPK）信号通路的不断激活[12]。因此，MAPK信号通路作为发现新型抗癌药物的潜在靶点受到了广泛关注，尤其是通过抑制BRAF_WT/V600E来实现[13]。

几种结构不同的小分子已被FDA批准用于临床治疗或处于临床试验阶段，作为靶向癌症疗法[14]，其中索拉非尼（一种双芳基脲衍生物）是对BRAF（IC₅₀ = 22 nM）和BRAF_V600E（IC₅₀ = 38 nM）有效的抑制剂[15]、[16]。LY3009120是一种吡啶并嘧啶-脲缀合物，对BRAF_WT（IC₅₀ = 9.1 nM）和BRAF_V600E（IC₅₀ = 5.8 nM）激酶具有很强的抑制作用，并且对表达BRAF突变的多种细胞系表现出显著的抗增殖活性[17]。AZ628是由阿斯利康公司开发的一种基于N-甲基喹唑啉酮的抑制剂[18]，它对BRAF_V600E（IC₅₀ = 34 nM）具有很强的抑制效果[18]。GNE-0749是另一种N-甲基喹唑啉酮衍生物，作为一种选择性的Pan-Raf抑制剂（BRAF K_i < 0.080 nM）[19]，也对表达BRAF和KRAS突变的多种细胞系表现出强大的抗癌活性（图1）[19]。

已经开发出多种基于抗菌酮的化合物作为有前景的抗癌候选物，它们通过不同的机制发挥作用，包括抑制BRAF_WT/V600E激酶变体[20]、[21]。此外，一些抗菌酮-喹唑啉酮衍生物被设计为双重靶向EGFR和BRAF_V600E激酶的抗增殖剂[22]。2021年，Mohassab等人[23]开发了一种基于三唑喹啉的抗菌酮衍生物I，其对A-549、MCF-7、Panc-1和HT-29癌细胞系表现出较强的抗癌活性，IC₅₀值分别为4.7、4.9、4.5和4.9 μM，这是通过抑制BRAF_V600E（IC₅₀ = 1.1 μM）实现的[23]。在同一研究中，Abou-Zeid等人[24]设计了一种2-吡啶酮-抗菌酮缀合物II，其对测试的癌细胞系表现出显著的抗增殖活性，IC₅₀值在亚微摩尔范围内（0.5–0.9 μM），同时对BRAF_V600E具有很强的抑制作用（IC₅₀ = 89 nM）[24]。Abdelaziz等人的研究[25]报道了一种嘧啶-抗菌酮杂合体III，其对一系列癌细胞系表现出强烈的抗增殖活性（NCI-60全面评估的平均IC₅₀值 = 2.04 μM），并且对人类成纤维细胞系无细胞毒性[25]。化合物III也对BRAF_WT和BRAF_V600E表现出强烈的抑制作用，IC₅₀值分别为0.201和0.101 μM（图2）[25]。

此外，包括喹唑啉酮在内的各种杂环化合物已被报道为设计针对BRAF激酶变体的抗癌药物的理想骨架[5]、[26]。Al-Wahaibi及其同事[27]开发了基于2-吡啶酮的N-烯丙基喹唑啉酮衍生物IVa、b，它们通过对BRAF_V600E的抑制作用（IC₅₀值分别为0.14和0.19 μM），对A-549、MCF-7、Panc-1和HT-29癌细胞系表现出强烈的抗增殖活性[27]。Ali等人[28]报道了一系列基于苯并咪唑-喹唑啉酮的杂合物Va-d，它们对BRAF_WT和BRAF_V600E具有很强的抑制作用（IC₅₀值范围分别为0.02–1.22 μM和0.002–0.37 μM），并且具有广谱抗癌活性[28]，其中化合物Vc对NCI-60癌细胞系的抗癌活性最强（GI₅₀值范围为1.1–15.9 μM）[28]。

最终，Hisham及其同事[29]利用这两种骨架合成了N-烯丙基喹唑啉酮-抗菌酮杂合体VI（图2），其对测试的癌细胞系表现出强烈的抗癌活性，IC₅₀值范围为1.05–1.40 μM，同时对EGFR和BRAF_V600E具有极高的抑制作用（IC₅₀分别为0.11和0.65 μM）[29]。

在此背景下，作为我们持续开发基于抗菌酮的抗癌药物的努力的一部分，以及之前报道的抗菌酮和喹唑啉酮衍生物III、Vc和VI所展示出的良好BRAF抑制和抗癌活性，设计并合成了一系列新的抗菌酮-喹唑啉酮缀合物4a-l。这两种骨架通过硫代乙酰胺间隔链连接在一起，生成能够靶向BRAF激酶关键区域的杂化分子。设计策略旨在保持II型BRAF抑制所需的基本相互作用（图3）。庞大的喹唑啉酮骨架旨在占据疏水性别构口袋，以增强与其的疏水相互作用并进一步提高化合物的结合亲和力。此外，在喹唑啉酮骨架上引入了甲基和乙基取代基，以探究烷基大小和疏水性对别构口袋占据的影响及其对激酶结合亲和力的影响。而硫代乙酰胺-酰胺连接剂的设计是为了通过与Glu500和Asp593的关键相互作用将分子固定在门控区域。同时，抗菌酮部分被定向到铰链区域，使得末端芳香环能够与铰链区域残基建立有利的疏水接触。通过这种排列，设计的杂化分子预计能够有效覆盖BRAF活性位点的三个主要识别区域（铰链区域、门控区域和疏水性别构口袋）（图3）。首先评估了合成化合物对BRAF_WT的抑制活性，随后对最有效的类似物进行了对BRAF_V600E的抑制活性评估。此外，还研究了它们对表达BRAF的选定癌细胞系及正常细胞的抗增殖活性，并估计了细胞周期、细胞凋亡诱导情况以及一些细胞凋亡标志物。还进行了分子动力学模拟，以研究最活跃化合物/BRAF复合物的动态稳定性。

章节摘要

化学

结论

general remarks

用于合成和HPLC分离的化学品、试剂和溶剂均从商业供应商处购买。薄层色谱（TLC）是在预涂硅胶60 F245铝片上进行的，并通过紫外光观察。熔点值使用熔点分析仪（Daihan Scientific，MP360D，韩国）测量，未进行校正。红外光谱通过FT/IR傅里叶变换红外光谱仪（8400 Shimadzu，京都，日本）记录，使用KBr作为光谱检测剂。

CRediT作者贡献声明

Randa Atef Ibrahim Abdelaziz：撰写——初稿，方法学，资金获取。Iman Ahmed Youssef Ghannam：撰写——审核与编辑，撰写——初稿，可视化，验证，项目管理，调查，正式分析，数据管理，概念化。Heba Abdelrasheed Allam：撰写——初稿，项目管理。Ahmed Mahmoud El Kerdawy：撰写——审核与编辑，撰写——初稿，验证，方法学。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报道工作的财务利益或个人关系。

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