《Bioorganic Chemistry》：Biochemical and functional divergence of phenylalanine ammonia-lyase isoforms involved in specialized metabolism in
Salvia miltiorrhiza
编辑推荐：
•系统性表征揭示了SmPAL1、SmPAL2和SmPAL3不同的最大表观催化性能。•SmPAL1表现出相对较高的催化效率，并增加毛状根中的酚酸积累。•SmPAL2具有较低的Km但较低的kcat，并增加丹参酮IIA而不显著改变RA/SAB。•研究结果支持初级-次级代谢平衡阀工作模型
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系统性表征揭示了SmPAL1、SmPAL2和SmPAL3不同的最大表观催化性能。
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SmPAL1表现出相对较高的催化效率，并增加毛状根中的酚酸积累。
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SmPAL2具有较低的Km但较低的kcat，并增加丹参酮IIA而不显著改变RA/SAB。
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研究结果支持初级-次级代谢平衡阀工作模型，并认为SmPAL1是候选靶点。
引言
丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge.）是一种重要的药用植物，广泛用于传统中医药。其干燥根和根茎常用于治疗心脑血管疾病。现代药理学研究表明，丹参的提取物和纯化化合物具有多种生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗纤维化和心脏保护作用[1]、[2]。丹参的主要生物活性成分通常分为两类：水溶性酚酸和脂溶性丹参酮。迷迭香酸（RA）和丹酚酸B（SAB）是主要的酚酸成分，而丹参酮I、丹参酮IIA和隐丹参酮是主要的二萜醌类化合物[3]。由于这些化合物构成了丹参药理功效的主要物质基础，阐明其生物合成调控机制对于提高药用品质和推进基于代谢工程的育种策略具有重要意义[4]。
代谢工程已成为提高药用植物生物活性化合物产量的有效方法[5]。然而，特殊代谢物的生物合成受复杂代谢网络调控，其中多条途径相互连接；对单个下游基因的修饰通常只能带来有限的改进，而同时操作多个基因可能导致不可预测的结果[6]、[7]。因此，识别控制前体分配和代谢输出的关键调控酶至关重要。初级代谢为生长和发育提供碳骨架、能量和还原力，并为特殊代谢物提供前体[8]、[9]、[10]。大多数特殊代谢物的生物合成骨架来源于糖酵解、磷酸戊糖途径和三羧酸循环产生的中间体或氨基酸前体[11]、[12]。因此，位于途径入口或主要分支节点的酶是代谢工程的有吸引力的靶点[13]。在这些入口酶中，苯丙氨酸解氨酶（PAL）在初级代谢和特殊代谢之间的界面占据特别重要的位置。
为了更好地理解代谢网络中关键分支点酶的调控作用，我们研究组先前提出了“初级-次级代谢平衡阀基因”工作模型，该模型为研究初级和次级代谢之间的稳态协调提供了重要的概念框架。根据这一工作模型，某些限速酶可能作为代谢“阀门”，影响碳资源在初级和次级代谢网络之间的分配，从而影响初级代谢物流向下游次级代谢途径的比例。在这一工作模型中，我们之前的研究确定了SmDXS5作为具有特征性阀门基因行为的代表性例子[14]。作为苯丙烷途径的定位于入口的酶，PAL是此类阀门样调控的主要候选者。
苯丙氨酸解氨酶（PAL；EC 4.3.1.24）催化L-苯丙氨酸的非氧化脱氨反应，生成反式肉桂酸。该反应是苯丙烷途径的第一个定位于入口和限速步骤[15]。通过随后的羟基化、活化和分支特异性反应，反式肉桂酸生成酚酸、黄酮类、木质素和许多其他苯丙烷衍生物[16]。由于其在途径入口处的战略位置，PAL被广泛认为是控制苯丙烷代谢的关键调控酶[17]。先前的研究已在丹参中鉴定出三个PAL家族成员，即SmPAL1、SmPAL2和SmPAL3[18]。然而，这些PAL成员的功能表征迄今为止主要限于SmPAL1，特别是其与SmRCA的相互作用以及对酚酸和萜类积累的影响；相比之下，SmPAL2和SmPAL3的功能仍知之甚少。此外，尚未对三个SmPAL同工型进行系统的家族水平比较。同工型在表观催化效率、表观Km、最适反应温度以及体内代谢调控效应方面的定量差异尚未得到全面表征。鉴于PAL在苯丙烷途径中占据关键入口位置，阐明单个SmPAL同工型的功能专一性对于确定它们是否以及如何影响丹参中的酚酸和丹参酮代谢至关重要。尽管SmPAL1、SmPAL2和SmPAL3具有高度相似的氨基酸序列，但序列同一性本身不能预测这些同工型在功能上是冗余的还是专化的。在多种植物物种中，包括拟南芥[19]、角苔[20]和五味子[21]，不同的PAL同工型在表观Km、催化效率和最适反应温度方面存在差异。因此，表征每个SmPAL同工型的酶学特性对于确定哪个同工型可能作为代谢工程的最有效靶点至关重要。
在本研究中，系统研究了SmPAL1、SmPAL2和SmPAL3的结构和功能分化。异源表达并纯化重组蛋白，用于测定酶促动力学参数。进行同源建模和分子对接分析，以比较三个同工型之间的预测配体姿态和对接分数。此外，生成过表达SmPAL1、SmPAL2和SmPAL3的转基因丹参毛状根系，以评估单个同工型对代谢物积累和生物合成基因表达的影响。通过整合生化表征、结构分析和体内功能验证，本研究提供了对丹参中PAL同工型专一性的全面评估，并确定了未来代谢工程的目标靶点，以提高生物活性化合物的产量。
章节片段
菌株、质粒和试剂
在本研究中，分别使用大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)（Vazyme）进行克隆和蛋白表达。原核表达载体pEASY-Blunt E1（TransGen）具有类似pET的骨架，并携带氨苄青霉素抗性基因。植物转化载体pCAMBIA1305.2（北京天恩泽生物技术）携带卡那霉素抗性基因。对于pEASY-Blunt E1，将转化的E. coli BL21(DE3)细胞在含有50 μg/mL氨苄青霉素（北京百瑞吉）的LB琼脂平板上进行筛选。
丹参中PAL基因的鉴定与表征
BLAST分析证实，扩增的SmPAL1、SmPAL2和SmPAL3编码序列与各自参考序列的核苷酸同一性分别为99.77%、99.67%和99.20%，查询覆盖率为100%，E值为0.0，验证了扩增ORF的准确性。本研究中使用的完整编码序列见表S2。SmPAL1、SmPAL2和SmPAL3的理化性质汇总于表1。序列分析显示，开放阅读框
讨论
本研究表明，丹参中的三个苯丙氨酸解氨酶（PAL）同工型具有保守的结构特征，但在各自最适条件下测定时显示出不同的表观动力学参数，并在转基因毛状根中表现出不同的表型。SmPAL1、SmPAL2和SmPAL3均包含特征性的PAL结构域和形成4-亚甲基咪唑-5-酮（MIO）辅因子所需的保守Ala-Ser-Gly基序[29]。与
结论
本研究考察了SmPAL1、SmPAL2和SmPAL3的序列特征、动力学性质、预测结合模式以及毛状根表型。尽管三个同工型共享保守的PAL基序，但每个在各自最适条件下表现出不同的最大表观催化性能特征。对于SmPAL1，表观催化效率相对较高（kcat/Km = 6645 ± 336 M?1·s?1；kcat = 16.68 ± 0.52 s?1；Km = 2.51 ± 0.10 mM）。对于SmPAL2，表观Km相对较低
CRediT作者贡献声明
苏诗瑶：写作–原稿、验证、方法学。王翔：写作–审阅与编辑、可视化。张大川：监督。王静美：写作–审阅与编辑。谭舒婷：监督。李磊：监督。肖茂春：监督。闵荣婷：写作–审阅与编辑。李阿吉：写作–审阅与编辑。常苗苗：写作–审阅与编辑。王学勇：概念化。
资金来源
本工作受中央本级重大课题资助：珍贵中药资源可持续利用能力建设（编号2060302）。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何已知的竞争性财务利益或个人关系，可能影响本文报告的工作。
苏诗瑶|王翔|张大川|王静美|谭舒婷|李磊|肖茂春|闵荣婷|李阿吉|常苗苗|王学勇
