新型基于噻吩并[3,2-b]吲哚的潜在EZH2调节剂作为抗炎剂的合成、计算机模拟、体外和体内评价

《Bioorganic Chemistry》：Synthesis, in silico, in vitro and in vivo evaluation of novel thiophene[3,2- b]indole-based potential EZH2 modulators as anti-inflammatory agents

　　

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  生物电子等排体替换产生了具有抗炎潜力的新型噻吩[3,2-b]吲哚类EZH2抑制剂。
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  化合物164和164 M在EZH2 SET结构域内形成了稳定的相互作用。
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  化合物164表现出更优的结合亲和力和更有利的MM/GBSA能量。
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  化合物164和164 M在体外抑制了EZH2表达并减少了IL-1β和IL-6的产生。
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  化合物164和164 M在体内减轻了水肿、炎症介质产生和组织病理学损伤。

引言

细胞蛋白表达的调控既受基因序列控制，也受表观遗传机制（如组蛋白修饰和DNA甲基化）的影响，这些机制在肿瘤发生中起着关键作用[1]、[2]。作为表观遗传调控的主要驱动力，多梳抑制复合物2（PRC2）通过修饰染色质结构来有效沉默免疫调节基因和肿瘤抑制基因[3]。在该多蛋白复合体中，Zeste同源物增强子2（EZH2）作为关键催化组分，利用其甲基转移酶活性催化组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化（H3K27me3）[4]。由基因直接过表达以及功能获得性和功能丧失性点突变引起的异常EZH2活性已在多种恶性肿瘤中被报道，包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌以及非霍奇金淋巴瘤[5]、[6]。因此，抑制EZH2已成为肿瘤学治疗策略的基石[2]。EZH2靶向的临床验证以FDA批准他泽司他（tazemetostat）为范例，而伐利美司他（valemetostat）则代表了一种临床开发的EZH1/EZH2双重抑制剂[7]、[8]。尽管如此，许多正构EZH2导向抑制剂具有相似的含吡啶酮结构特征（图1），为探索结构不同的化学型留下了空间。已报道的EZH2抑制剂获得性耐药机制为持续开发替代性骨架提供了额外理由[2]、[9]。

除其已确立的致癌特征外，越来越多的证据将EZH2的病理学相关性扩展到慢性炎症和免疫介导疾病领域[4]、[10]。在病理状态下，EZH2在巨噬细胞中常被上调表达，导致抗炎通路的表观遗传抑制并促进促炎环境的形成[4]。与这一作用一致，据报道，EZH2的药理学抑制或遗传调控可减弱炎症反应并改变炎症和肿瘤相关环境中的免疫细胞表型[11]、[12]、[13]。这些发现表明，EZH2可能在表观遗传调控和炎症信号传导之间提供机制联系，支持其作为抗炎干预潜在靶点的研究。

为克服早期药效团的效力和药代动力学局限性，现代药物设计经常采用骨架跃迁来刚性融合柔性骨架，从而降低熵惩罚并增强结合亲和力[14]。我们之前将柔性YC-1（3-(5′-羟甲基-2′-呋喃基)-1-苄基吲唑）核心演化为更刚性的呋喃[3,2-b]吲哚[3]。在我们之前的研究中，将呋喃氧替换为更大且更易极化的硫原子，导致与所研究靶点的预测相互作用更有利，表明该取代可能改变配体识别[15]。这项工作随后确定了(4H-噻吩并[3,2-b]吲哚-3-基)甲醇（28i）为潜在的HIF-1抑制剂[15]。这一观察为检验含噻吩骨架是否也能在EZH2结合口袋内建立有利相互作用提供了依据。在寻找先进的表观遗传调控剂的过程中，正在探索各种小分子通过拮抗EZH2 SET结构域来干扰PRC2复合物[16]。我们团队之前的研究表明，YC-1增强了EZH2的降解速率和泛素化，诱导细胞凋亡，并抑制乳腺癌细胞中的肿瘤生长[3]。基于开发YC-1类似物和计算机辅助药物设计的既往经验，我们推测对化合物28i的呋喃-2-基甲基和羟甲基基团进行微小修饰可能产生新型EZH2调控剂[17]、[18]。基于这一原理，合成了两种化合物164（4-苄基-4H-噻吩并[3,2-b]吲哚-2-羧酸酯）和164 M（4-苄基-4H-噻吩并[3,2-b]吲哚-2-羧酸），作为靶向噻吩[3,2-b]吲哚衍生物，用于在本研究中进一步评估其抗炎活性（图2）。引入苄基取代基是为了有利于疏水性抑制剂结合区域内的范德华接触，而保留α-羧基取代的稠合噻吩部分作为靠近Tyr111和Cys663等残基的潜在相互作用元件[19]、[20]。化合物164先前已合成，对肾癌细胞、结肠癌细胞和正常Detro551细胞表现出非显著细胞毒性[15]；然而，其抗炎活性尚未被探索。化合物164 M通过水解164的酯基获得，是一种新化合物。

本研究旨在探讨两种合理设计的噻吩[3,2-b]吲哚衍生物164和164 M的抗炎潜力，并检验它们与EZH2调控的可能关联。合成了这些化合物并进行了表征，随后进行了分子对接、分子动力学模拟和初步ADMET评估，以评价其预测的结合行为和类药性质。随后在LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中检测了它们的生物学效应，通过评估细胞活力、EZH2表达和促炎细胞因子产生。最后，在角叉菜胶诱导的足跖水肿模型中评估了164和164 M的抗炎活性。

章节摘要

合成

化合物164和164 M的合成始于市售2-硝基苯胺1的重氮化反应，随后在CuCl₂存在下与噻吩-2-羧酸2进行亲电取代，得到中间体INT-1，其随后与MeOH和催化量的浓H₂SO₄反应，以40%的产率提供INT-2。INT-2的氢化反应容易生成INT-3。INT-3氨基部分的重氮化，随后热诱导环化

结论

总之，对化合物28i的结构修饰在噻吩[3,2-b]吲哚核心的呋喃-2-基甲基和羟甲基基团上引入，产生了化合物164和164 M，它们降低了LPS刺激的巨噬细胞中EZH2蛋白水平以及IL-1β和IL-6水平。分子建模研究为化合物164和164 M在EZH2催化SET结构域内的预测结合行为提供了计算依据。分子对接分析表明两者均

基本信息

所有溶剂和试剂均为市售可得，无需进一步纯化即可使用。反应进程通过薄层色谱（TLC）监测，使用预涂硅胶60 F₂₅₄板（2 × 6 cm，0.25 mm厚度；Merck）。色谱图在254或366 nm紫外光下显色。柱色谱使用硅胶60（Merck；粒径0.040–0.063 mm）作为固定相。¹H和¹³C核磁共振（NMR）谱

CRediT作者贡献声明

Wen-Ping Jiang: 写作 – 初稿，调查，数据管理。Hoang-Thuc Huynh: 写作 – 初稿，调查。Guan-Jhong Huang: 方法学。Yi-Ting Chiang: 调查，数据管理。Jin-Cherng Lien: 正式分析，数据管理。Phuong Thuy Viet Nguyen: 软件，数据管理。Quynh Nguyen Nhu Le: 软件，数据管理。Ting-Wei Zhang: 软件，数据管理。Shin-Hun Juang: 写作 – 审阅与编辑，概念化。Sheng-Chu Kuo: 监督，资金

伦理声明

本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。

本研究经中国医科大学动物护理委员会批准。

（批准号：CMUIACUC-2024–298）

资助

本研究主要由中国医科大学药物开发中心通过特色领域研究中心计划资助，该计划隶属于台湾教育部资助的高等教育深耕计划框架。部分支持由中国医科大学提供，台湾（CMU113-S-47）。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在已知的可能影响本文报告工作的竞争性经济利益或个人关系。

Wen-Ping Jiang|Hoang-Thuc Huynh|Guan-Jhong Huang|Yi-Ting Chiang|Jin-Cherng Lien|Phuong Thuy Viet Nguyen|Quynh Nguyen Nhu Le|Ting-Wei Zhang|Shin-Hun Juang|Sheng-Chu Kuo|Min-Tsang Hsieh