《Bioorganic Chemistry》：Streamlined enzymatic process for (
R)-α-lipoic acid intermediate production enabled by a high organic-solvent-tolerant carbonyl reductase
编辑推荐：
•羰基还原酶AxSDR对DCM具有耐受性。•对AxSDR进行工程改造，使其不对称催化ECOO生成(R)-ECHO。•化学制备的ECOO无需脱除溶剂即可被还原为(R)-ECHO。•该酶促还原反应与生产(R)-α-LA的化学步骤兼容。引言α-硫辛酸（α-LA）是一种天然存在的含硫脂肪
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羰基还原酶AxSDR对DCM具有耐受性。
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对AxSDR进行工程改造，使其不对称催化ECOO生成(R)-ECHO。
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化学制备的ECOO无需脱除溶剂即可被还原为(R)-ECHO。
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该酶促还原反应与生产(R)-α-LA的化学步骤兼容。
引言
α-硫辛酸（α-LA）是一种天然存在的含硫脂肪酸，兼具脂溶性和水溶性[1]。它是一种强效抗氧化剂，广泛应用于医药[2], [3], [4], [5]、化妆品[6]、保健品[7], [8]、材料科学[9], [10]以及水果保鲜[11], [12]等领域。α-LA存在两种对映体形式：(R)-α-LA和(S)-α-LA；然而，(R)-对映体被视为主要活性成分[13]。因此，(R)-α-LA的市场价格是外消旋α-LA的四倍以上。近年来，开发(R)-α-LA的不对称合成方法已成为提高原料原子经济性、降低(R)-α-LA生产成本的关键重点。
目前生产(R)-α-LA的主要工业方法是己二酸单乙酯法（方案1）[14]，该方法涉及9个化学反应步骤的复杂工艺，并产生大量废弃物。该方法不符合绿色发展的原则，且受限于50%的最高产率[1]。在这种化学方法中，中间体醇8-氯-6-羟基辛酸乙酯（ECHO，2）的构型决定了α-LA的最终立体化学。因此，近年来的研究重点是利用(R)-ECHO [(R)-2]代替外消旋ECHO (rac-2)来合成(R)-α-LA，从而将9步反应序列缩短为6步（方案1）。这一改进不仅提高了己二酸的原子经济性，还简化了工艺并提高了产物的光学纯度。随着对羰基还原酶研究的深入以及其底物特异性和立体选择性调控策略的成熟[15], [16], [17]，利用羰基还原酶不对称还原8-氯-6-氧代辛酸乙酯（ECOO，1）以合成(R)-ECHO已成为降低(R)-α-LA生产成本、提高效率的重要研究方向。郑高伟等人[13]通过基因组挖掘和蛋白质工程开发了一种高效的酮酯还原酶CpAR2-S131Y/Q252I。携带CpAR2-S131Y/Q252I和葡萄糖脱氢酶（GDH）的冻干E. coli细胞可在4小时内将110 g/L ECOO转化为(R)-ECHO，时空产率达566 g·L?1·d?1，对映体过量值（ee）>99%。陈芬儿等人[18]改造了酮还原酶SsCR-L211H/V127A/L135I，并与葡萄糖脱氢酶偶联，可在14小时内将260 g/L 8-氯-6-氧代辛酸甲酯（MCOO）转化为(R)-8-氯-6-羟基辛酸甲酯 [(R)-MCHO]，时空产率达391 g·L?1·d?1，ee为98%。余宏伟等人[19]开发了一种白色念珠菌羰基还原酶突变体Cat-S126A/R129Q/V194A，以粗酶液为催化剂。该系统在5小时内催化220 g/L ECOO，转化率达98%，时空产率为696 g·L?1·d?1，ee为98%。马钦源等人[20]通过两步通道工程开发了一种羰基还原酶变体CoCR13-M3。以粗酶CoCR13-M3和葡萄糖脱氢酶（GDH）为催化剂，150 mM ECOO在20分钟内完全转化为(R)-ECHO（ee >99%），时空产率达99.9 g·L?1·h?1。最近，罗志波等人[21]将醛酮还原酶（AKR）包封在ZIF-8纳米颗粒中。所得AKR@ZIF-8复合材料与GDH共嵌入海藻酸钙（CA）水凝胶网络中，形成一种结构明确的核壳催化剂，称为AKR@ZIF-8-GDH@CA。使用该固定化酶，高效合成了(R)-ECHO（ee > 99%），且经过10次重复使用后活性仍保持85%。尽管这些研究报道的底物载量和时空产率满足大规模生产标准，但均基于纯化的ECOO。然而，据我们所知，纯化的ECOO不稳定，这要求在工业过程中将ECOO脱溶剂步骤与酶催化步骤紧密结合，从而导致与上游化学反应兼容性差。因此，有必要开发对ECOO储备液（20% v/v ECOO溶于DCM）具有耐受性的生物催化剂，使酶还原过程无需从底物中脱除溶剂即可进行。
在前期研究中，我们从新疆产碱杆菌（Algoriella xinjiangensis）中分离出一种羰基还原酶AxSDR，其对异丙醇表现出高耐受性[22]。进一步分析表明，该酶也能耐受50% DCM。然而，它对ECOO没有活性。结构研究表明，AxSDR的底物结合口袋遵循典型的Anti-Prelog模式，不适合催化(R)-ECHO的合成。通过多轮蛋白质工程，我们扩展和重塑了底物结合口袋中的空腔，并微调了边缘位点的极性和柔性。该过程最终获得了一个六点突变体H145C/Y188C/G94L/S153I/L206I/M198L（Mu6）。当与葡萄糖脱氢酶BtGDH共表达时，全细胞系统在最佳反应条件下于10小时内将50% ECOO储备液（最终ECOO浓度约100 g/L）转化为(R)-ECHO，ee大于99%。该方法无需从ECOO底物中脱除溶剂，使其直接参与酶催化反应，并确保了ECOO的稳定性。反应后，用DCM萃取的有机相可用于后续氯化反应，有效地实现了还原过程与上下游化学反应的无缝衔接。
章节片段
菌株、质粒、引物和试剂
表达宿主大肠杆菌 BL21 (DE3) 以及质粒pET30a-axsdr、pCDFDuet-btgdh和pCDFDuet-cbfdh保存于实验室。所用引物由北京擎科生物科技有限公司合成，列于表S1。硫酸卡那霉素、苯乙酮和异丙醇（IPA）购自阿拉丁生化科技有限公司（上海）。DNA聚合酶KOD One和限制性内切酶DpnI购自东洋纺生物科技有限公司（日本）。质粒
有机溶剂耐受性羰基还原酶AxSDR及其anti-Prelog催化特性
前期研究发现羰基还原酶AxSDR可以耐受高浓度异丙醇[22]，提示其可能是一种有机溶剂耐受性酶。因此，进一步评估了AxSDR对ECOO溶剂（DCM）的耐受性，结果如图1A所示。在还原模型底物苯乙酮的过程中，AxSDR耐受50% DCM，在该浓度下保持超过80%的催化活性。因此，AxSDR被选作
结论
本研究旨在解决(R)-α-LA化学合成中的一个关键问题：还原步骤（将ECOO转化为ECHO）仅产生外消旋ECHO。因此，随后的氯化、环化和水解反应产生外消旋α-LA。这一局限性使得至少需要两轮拆分才能获得ee大于95%的(R)-α-LA。为了克服这一挑战，需要一种能够耐受ECOO储存溶剂（DCM）并不对称
CRediT作者贡献声明
张涛：写作 – 初稿、调查、数据管理。 刘丽霞：方法学、数据管理。 廖小云：数据管理。 刘玲玲：调查。 罗一伙：方法学。 苏炳梅：写作 – 审阅与编辑、资金获取。 林娟：监督、概念化。
资金来源
本工作由福建省科技计划项目资助 [项目编号 2025I1005]。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在已知的会影响到本研究报告工作的竞争性经济利益或个人关系。
致谢
我们感谢福建省科技计划项目（项目编号：2025I1005）的资金支持。同时，我们也要感谢刘康伟硕士在NMR分析方面提供的帮助。
张涛|刘丽霞|廖小云|刘玲玲|罗一伙|苏炳梅|林娟
