《Twin Research and Human Genetics》：Reduced Diagnostic Yield of Whole Exome Sequencing in Patients With Chromosomal Microarray Detected Copy Number Variants of Uncertain Significance
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染色体微阵列（chromosomal microarray）是许多神经发育障碍和先天性异常个体的第一线基因检测。常见结果是识别出意义未明的拷贝数变异（copy number variant of uncertain significance, CNV VUS）
染色体微阵列（chromosomal microarray）是许多神经发育障碍和先天性异常个体的第一线基因检测。常见结果是识别出意义未明的拷贝数变异（copy number variant of uncertain significance, CNV VUS），常促使转诊至临床遗传学服务。在发现CNV VUS的情况下，临床遗传学家常继续进行全外显子组测序（whole exome sequencing, WES），以确定是否存在替代性分子诊断。本研究旨在确定染色体微阵列检出的CNV VUS个体与无可报告CNV的个体相比，WES诊断收益是否不同，并利用该差异估计CNV VUS可能致病的比例。纳入2022年1月至12月在Genetic Health Western Australia接受WES的个体。通过回顾性病历审查收集表型和结果。结果发现，接受WES的177例个体中32例（18%）在微阵列上有异常发现。WES在总体上识别出27%的致病性变异，CNV VUS者的诊断收益低于无CNV VUS者（11% vs. 30%，p = .023）。在13例CNV VUS重复患者中，WES未作出诊断（p = .020）；在16例CNV VUS大小为0.6Mb或更大的个体中亦未作出诊断（p = .006）。研究结论认为，CNV VUS个体的WES诊断收益显著较低，提示染色体微阵列识别出的许多可报告CNV VUS本身即导致就诊表型。基于观察到的诊断收益差异，约半数CNV VUS可能代表潜在的分子诊断。
研究背景与问题：染色体微阵列（chromosomal microarray）是神经发育障碍（neurodevelopmental disorders）和先天性异常（congenital anomalies）患者的一线遗传检测。其常见结果为意义未明的拷贝数变异（copy number variant of uncertain significance, CNV VUS），常导致转诊至临床遗传学服务。由于CNV VUS是否解释表型难以确定，临床遗传学家常申请全外显子组测序（whole exome sequencing, WES）寻找替代分子诊断；但CNV VUS后WES诊断收益此前未被量化。若WES在CNV VUS者中诊断率显著降低，则提示许多可报告CNV VUS本身即为致病原因。该研究旨在比较有/无微阵列检出CNV VUS者的WES诊断收益，并据差异估计CNV VUS可能致病的比例。研究人员回顾性纳入2022年1—12月Genetic Health Western Australia全部WES个体（n = 177），为全州单中心、多学科病例复核的混合队列，表型与结果来自病历和临床检测报告。结果发现，CNV VUS者WES诊断收益显著低于无报告CNV者（11% vs. 30%，p = .023），提示许多可报告CNV VUS本身导致表型；据差异估计约半数（58%，17.9/31）CNV VUS可能为潜在分子诊断。其意义在于首次量化该诊断收益下降，阴性WES可增加原CNV VUS的临床相关性，支持持续重解释和合理使用新技术。
方法上，研究纳入2022年1—12月通过Genetic Health Western Australia申请WES的全部177例个体，为全州单中心、多学科病例复核的混合队列；表型和结果来自回顾性病历及临床检测报告。关键方法包括：全基因组单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）染色体微阵列分析（由PathWest、Western Diagnostic Pathology和QML Pathology使用Illumina HumanCytoSNP-12 BeadChip、Illumina GSAv2 plus Psych MD v1 array或Affymetrix Cytoscan平台完成）；WES采用TWIST Exome Panel，Illumina NextSeq550测序，DRAGEN Enrichment v3.6.3以GRCh38比对，Alissa Interpret v5.3进行三级分析；微阵列报告按美国医学遗传学与基因组学学会/临床基因组资源（American College of Medical Genetics and Genomics/Clinical Genome Resource, ACMG/ClinGen）和ACGS标准复核，GRCh37坐标经UCSC liftover转换为GRCh38；统计采用Fisher精确检验。
Chromosomal Variants Preceding WES：回顾性分析显示，177例中32例（18%）有可报告CNV，4例（2%）为致病/可能致病，28例（16%）为VUS；所有CNV均未充分解释表型而进入WES，1例CNV者WES VUS被排除。32例中16例（50%）为缺失，13例（41%）为重复（含1例X三体），3例（9%）兼有重复和缺失；VUS分为含OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man）致病基因、不完全外显、无OMIM致病基因和携带者状态。
Yield of Whole Exome Sequencing：WES在47/177（26%）检出致病性变异，125/177（71%）未检出，5/177（3%）为WES VUS；2例有多项发现：1例PACS1致病与PAX3可能致病解释混合表型，1例纯合致病PLG为偶然发现并有CLTC VUS但亲本检测不可用。
Effect of CNV on WES Yield：CNV VUS组WES诊断收益11%，无微阵列发现组30%（p = .023）；13例孤立CNV VUS重复均无WES诊断（p = .020）；15例孤立CNV VUS缺失中3例（20%）有WES致病发现；3/31兼有缺失和重复者中1例获WES诊断。4例（ID 20、40、123、160）同时有可报告CNV和WES可能致病/致病发现，外显子发现均完全解释表型；ID 160携带15q11.2缺失（低外显率，涉及NIPA1），一缺失涉及5’ FOCAD，另两缺失≤0.53Mb且无已知致病基因。16例CNV≥0.6Mb者均无WES诊断（p = .006）。以4/(31 ? x) = 43/141推算x = 17.9，即58%（17.9/31）CNV VUS可能为遗传诊断所在；该计算假设单一单基因病因且受样本量小限制。
讨论部分总结：主要发现是CNV VUS者WES诊断收益较低，最可能解释是许多CNV VUS已代表潜在分子诊断；全州真实世界2022年完整捕获显示11% vs. 30%。CNV报告与再分析方面，CNV解释困难且实验室报告有差异；ACMG/ClinGen评分范围为?0.99至0.99，VUS为?0.89至0.89，原文建议实验室在报告中标注层级；VUS需定期再评估。Ravel et al.再分析259例CNV VUS，3%升级为致病/可能致病、30%降级为良性/可能良性，多数降级CNV<500kb，且与CNV类型无关。重复队列中13例孤立重复均未诊断（9例>500kb）；原文讨论的可能机制包括三倍敏感（triplosensitivity）、部分重复-倒位、表观遗传与拓扑关联结构域（topologically associated domains, TADs）改变、插入破坏、调控元件及融合基因等。其他方法方面，光学基因组图谱（optical genome mapping, OGM）可分析结构变异（structural variant, SV）并检测小至30kb的变异；长读长测序、细胞模型、多组学、机器学习、ChIP-Seq和Hi-C测序等可能帮助解释CNV VUS。
研究结论部分翻译：临床遗传专业人员熟悉CNV VUS解释及是否进一步检测的挑战。本研究首次量化既存CNV VUS相关的WES诊断收益下降。临床医生不应仅将WES视为寻找替代诊断；阴性WES结果增加原CNV VUS具临床相关性的可能性。研究人员不建议在此情形放弃WES；相反，无结论性外显子结果应促使重新考虑CNV VUS、持续重解释，并在适当时使用新兴技术以更好界定其生物学后果。
