《Journal of Bacteriology》：Secretion of the Francisella pathogenicity island effector protein PdpE requires components of both the Sec and Type IV pilus secretion pathways
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摘要：弗朗西斯菌致病决定蛋白E（Francisella pathogenicity determinant protein E, PdpE）是一种功能未知的蛋白，由弗朗西斯菌致病岛（Francisella pathogenicity island, FPI）内
摘要：弗朗西斯菌致病决定蛋白E（Francisella pathogenicity determinant protein E, PdpE）是一种功能未知的蛋白，由弗朗西斯菌致病岛（Francisella pathogenicity island, FPI）内VI型分泌系统（Type VI secretion system, T6SS）基因簇编码，该区域对细菌胞内复制和毒力至关重要。研究人员此前已证明PdpE通过不依赖T6SS的途径被细菌分泌，但具体途径尚不清楚。本研究中，研究人员在F. novicida中研究了PdpE分泌，并证明其需要Sec通用分泌途径（Sec general secretory pathway）和IV型菌毛（Type IV pilus, T4P）分泌系统的组分。F. novicida拥有两个SecB旁系同源物（paralogs），其中任一均足以维持细菌存活力，并足以支持T4P介导的几丁质酶（chitinase）和PepO酶活性分泌。相反，研究人员发现两个旁系同源物均为T4P介导的PdpE分泌所必需。细菌双杂交（bacterial two-hybrid）和下拉实验（pulldown assay）证实了这两个SecB分子伴侣（chaperone）之间的相互作用。基因组分析表明，两个secB旁系同源物的存在是Francisellaceae科内保守特征，包括缺乏pdpE的物种，提示尽管二者具有重叠和部分冗余功能，但已进化出额外的专门分子伴侣和/或调控功能。重要性：本研究表明，弗朗西斯菌中PdpE分泌需要Sec通用分泌途径和T4P分泌系统组分，使其成为已知首个使用替代途径的、由T6SS基因簇编码的基因产物。尽管PdpE与PdpC存在遗传连锁，但其对替代分泌途径的依赖可能为理解其生理作用提供线索。此外，研究人员证明，Francisella中T4P介导的PdpE分泌需要双SecB分子伴侣旁系同源物，生物测定表明两种不同分子伴侣之间存在直接相互作用。基因组分析揭示，拥有两个secB旁系同源物是Francisellaceae科内的保守特征。
研究背景与问题：Francisella tularensis是一种高传染性革兰阴性兼性胞内病原菌，引起土拉热（tularemia），可在巨噬细胞内感染并快速增殖。FPI对细菌毒力、胞内存活和致病性必需，并指导T6SS这种多蛋白纳米机器装配，将效应分子注入宿主细胞胞质。多种FPI编码蛋白（如IglC、IglF、IglG、VgrG、PdpA、PdpC、PdpD）及FPI外编码的OpiA、OpiB1–3分泌依赖T6SS。PdpE位于FPI中pdpC紧邻位置；预印本曾提出PdpE可能调节PdpC功能、降低PdpC对宿主细胞毒性以便多轮复制，但该功能尚未经正式发表证实，其生物学功能仍不清楚。研究人员此前发现PdpE可在TSBC中分泌，而在含5% KCl、可诱导T6SS装配和效应蛋白分泌的TSBC中PdpE分泌可忽略，提示PdpE经不依赖T6SS的机制分泌。Francisella中T6SS和T4P机械是两种主要蛋白分泌机制，目前无功能性III型分泌系统（Type III secretion system, T3SS）或IV型分泌系统（Type IV secretion system, T4SS）证据。革兰阴性菌跨内膜运输未折叠多肽主要经Sec途径，跨周质后跨外膜可经II型分泌系统（Type II secretion system, T2SS）或自转运体（autotransporter）；Francisella缺乏经典T2SS，但其T4P核心组分PilB（GspE同源物，ATP酶马达）、PilC（GspF同源物，内膜装配平台）和PilQ（GspD同源物，外膜孔道）与T2SS相似。F. novicida T4P可介导几丁质酶ChiA和ChiB、几丁质结合蛋白CbpA、β-葡萄糖苷酶BglX及锌金属蛋白酶PepO等分泌。F. novicida U112基因组编码两个secB分子伴侣旁系同源物secB1（FTN_0121）和secB2（FTN_1510），双基因敲除不可存活；PdpE含188个氨基酸，SignalP 6.0预测其前21个残基为可切割的Sec途径分泌信号序列。因此，作者提出PdpE可能先经Sec途径靶向周质，再由T4P机械输出至胞外，并围绕该两步模型开展研究。
研究人员开展的研究、结论及意义：研究人员通过分泌实验、遗传互补、细菌双杂交、下拉实验及基因组和系统发育分析，证明PdpE分泌同时需要SecB1和SecB2两个分子伴侣以及T4P组分PilA、PilB、PilC和PilQ；T4P突变导致加工型PdpE在菌内积累，支持Sec跨内膜、T4P跨外膜的两步分泌模型。两个SecB旁系同源物可发生同型与异型相互作用；双secB基因在Francisellaceae中保守。该研究的意义在于：PdpE是首个被证明不依赖T6SS分泌的FPI编码效应蛋白；双SecB旁系同源物对PdpE的T4P介导分泌具有专门要求，提示其可能进化出额外调控或分子伴侣功能；研究为理解Francisella T4P介导蛋白分泌及PdpE生理作用提供了证据。
关键技术方法（不超过250字）：研究人员以F. novicida U112及衍生缺失/互补株为材料，采用分泌实验比较培养上清与菌体裂解物，经SDS-PAGE和Western blot检测PdpE-FLAG或染色体PdpE-ALFA，并以荧光底物测定几丁质酶和PepO酶活性；用细菌腺苷酸环化酶双杂交（bacterial adenylate cyclase-based two-hybrid, BACTH）和Ni-NTA下拉实验检测SecB1/SecB2相互作用；从NCBI GenBank等获取130个完整注释Francisella基因组及UniProt序列，用Clustal Omega和邻接法进行系统发育分析。样本来源为F. novicida U112及衍生株、大肠杆菌报告株和公共基因组序列。
研究结果：1）PdpE分泌需要Sec和T4P分泌系统二者。研究人员用表达PdpE-FLAG的F. novicida进行分泌实验，发现无KCl时PdpE分泌明显，而高KCl时分泌显著降低；高KCl也明显抑制T4P底物几丁质酶和PepO分泌，提示高KCl总体抑制T4P介导分泌。缺失任一secB或T4P组分pilA、pilB、pilC、pilQ均消除PdpE分泌；亲本菌株裂解物中PdpE呈双带，低分子量主带为分泌至培养基的成熟PdpE，弱上带为secB突变体中未加工形式；T4P突变体中成熟PdpE带增强，说明PdpE经Sec跨内膜并切除信号序列，但T4P破坏后加工型PdpE在周质积累。回补野生型secB或T4P基因可恢复PdpE分泌；染色体pdpE-ALFA标记实验同样显示缺失任一secB显著降低PdpE-ALFA分泌，缺失secB1或secB2还降低菌体PdpE水平，提示未折叠PdpE不稳定并需SecB1/SecB2维持稳定性；由于secB双敲不可得，研究人员用FLAG-SecB1+SecB2或SecB1+FLAG-SecB2互补后双敲，均恢复PdpE-ALFA分泌。T4P突变回补pilA、pilC或pilQ可恢复PdpE分泌，pilB回补仅部分恢复；几丁质酶和PepO分泌同样依赖T4P，pilA、pilC或pilQ回补可完全恢复其培养上清活性。其他陆生Francisella（F. tularensis、F. hispaniensis、F. opportunistica、F. persica）PdpE经SignalP 6.0预测高度可能含Sec依赖信号肽并由信号肽酶I切割。2）Francisella中SecB同源物彼此相互作用。研究人员用BACTH系统将secB1和secB2与百日咳博德特菌（Bordetella pertussis）腺苷酸环化酶催化域T18或T25片段融合，X-gal指示板上SecB1和SecB2各自可自关联，SecB1与SecB2在多种N端或C端融合方向共表达均形成蓝色菌落，阳性对照IglA-T25与T18-IglB、阴性对照空T18载体结果符合预期，表明两个SecB具有同型和异型相互作用。Ni-NTA下拉实验中，His标签SecB1或SecB2可捕获FLAG标签SecB2或SecB1，而无His标签时FLAG-SecB不被树脂捕获，证实F. novicida中两蛋白直接相互作用。3）SecB蛋白的系统发育分析。研究人员调查NCBI GenBank中130个完整注释Francisella基因组，发现所有菌株均携带两个secB基因；两Francisella SecB蛋白在系统发育上分属不同分支，且与其他主要γ-变形菌同源物高度分化，其最近进化亲属属于海洋细菌Kangiella属；两secB基因位于不同染色体位点，通常一个邻接mutS错配修复基因，另一个位于DNA修复和同源重组基因recA、recX和ssb上游，Allofrancisella、Candidatus F. endociliophora FSC1006、F. adeliensis和F. uliginis TX07-7310存在少数基因座排列变异。
讨论总结与研究结论翻译：讨论指出，在陆生致病性Francisella中pdpC和pdpE均为FPI组成部分，而水生种缺乏；PdpE经Sec/T4P途径分泌，是首个被证明不依赖T6SS分泌的FPI编码效应蛋白。作者假设，分开的分泌途径可使PdpE与其他FPI编码效应蛋白的分泌受到差异调控，使PdpE作为其他FPI效应蛋白的调节者或在胞内感染不同阶段分泌；PdpE与PdpC虽可相互作用，但该相互作用似乎发生在胞外而非菌内，二者在菌内可能分别结合不同分子伴侣（PdpC结合T6SS相关分子伴侣，PdpE结合SecB1/SecB2）。讨论还指出，F. tularensis subsp. holarctica和subsp. tularensis基因组编码T4P系统，其表面可见T4P菌毛；预印本报道F. tularensis subsp. holarctica LVS也利用T4P分泌几丁质酶ChiA、ChiD和过氧化氢酶KatG，鉴于T6SS、T4P和Sec系统序列高度同源，作者预期Sec/T4P介导的PdpE分泌也适用于医学重要F. tularensis，但尚待证明。多数细菌仅有一个染色体secB，部分细菌编码多个secB旁系同源物以执行替代分子伴侣或调控功能；本研究显示PdpE分泌需要两个SecB旁系同源物，缺失任一则全长PdpE不能有效靶向Sec转位子进行加工，且T4P组分PilA、PilB、PilC、PilQ为PdpE跨外膜进入胞外所必需。BACTH和下拉研究提示两个SecB可能形成异源四聚体，仍需生化和结构研究确定其互作方式及各自是否承担不同分子伴侣作用。SecB1和SecB2均为PdpE经T4P分泌所必需，而任一单独存在即足以支持PepO和几丁质酶T4P介导分泌；ChiA和PepO均预测含信号肽并经Sec途径加工，作者假设其与PdpE一样先经Sec跨内膜、再经T4P输出，PdpE对双SecB的特殊需求可能反映SecB分子伴侣已进化出对PdpE分泌的额外调控。研究结论（译自原文）：PdpE经Sec/T4P途径分泌，是首个被证明不依赖T6SS分泌的FPI编码效应蛋白；PdpE分泌需要Sec和T4P组分，且双SecB分子伴侣旁系同源物为T4P介导的PdpE分泌所必需并可直接相互作用。该分泌模式符合活塞模型：PdpE被翻译后由SecB1/SecB2以未折叠状态分子伴侣并递送至Sec转位子进入周质；在周质中PdpE与含PilA的假菌毛结合，假菌毛依赖PilB ATP酶动力作为活塞将PdpE经PilQ secretin孔推入胞外空间。
