《Veterinary Sciences》：Development, Application and Epidemiological Analysis of a TaqMan-Based RT-qPCR Assay for Nairobi Sheep Disease Virus in China
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内罗毕羊病病毒（Nairobi sheep disease virus，NSDV）是一种典型的蜱传病毒，属于正内罗病毒属（Orthonairovirus），科属为内罗病毒科（Nairoviridae），可引起绵羊和山羊等小型反刍动物发生内罗毕羊病（Nairob
内罗毕羊病病毒（Nairobi sheep disease virus，NSDV）是一种典型的蜱传病毒，属于正内罗病毒属（Orthonairovirus），科属为内罗病毒科（Nairoviridae），可引起绵羊和山羊等小型反刍动物发生内罗毕羊病（Nairobi sheep disease，NSD），死亡率超过70%。该病原体也与人类感染相关，凸显其人兽共患潜力。在本研究中，研究人员建立了一种基于TaqMan探针的逆转录定量实时PCR（reverse-transcription quantitative PCR，RT-qPCR）检测方法，用于中国地区的NSDV检测。该方法显示出较高的分析灵敏度；使用重组质粒DNA确定的检出限（limit of detection，LOD）为10拷贝/微升，这仅代表qPCR扩增步骤的性能，标准曲线显示出极佳的线性（R2=1.000）。该方法对NSDV表现出良好的分析特异性，未与其他相关病原体产生交叉扩增。重组质粒标准的批内和批间变异系数均低于1%，表明具有高度可重复性。随后，研究人员将该RT-qPCR方法应用于定量实验感染绵羊多个组织中的病毒载量。在感染后第3天和第7天，在心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、十二指肠、空肠、直肠、盲肠、回肠和淋巴结中均可检测到NSDV核酸。描述性分析显示，在感染后第3天和第7天，脾脏和肺中的NSDV RNA载量均高于其他组织。在感染后第3天的脾脏中检测到的最大RNA载量为104.428拷贝/毫克，表明脾脏和肺是NSDV RNA积累最高的组织。同时，该检测方法被用于对中国黑龙江省部分地区绵羊和蜱虫中的NSDV核酸进行流行病学调查。绵羊中NSDV RNA的检出率为3.46%（33/955），蜱虫中为2.88%（20/694）。系统发育分析显示，源自蜱虫的NSDV序列（命名为NSDV/HLJ-1/tick/China/2023）在中国NSDV进化支内形成一个独特谱系，并与来自中国的NSDV SZWH2毒株具有相对较高的核苷酸同源性。总之，这种准确且灵敏的RT-qPCR检测方法为实验室基于NSDV的检测和流行病学监测提供了一个强有力的工具。
研究背景与意义
内罗毕羊病病毒（Nairobi sheep disease virus，NSDV）是一种由蜱传播的负链单链RNA病毒，属于内罗病毒科（Nairoviridae）正内罗病毒属（Orthonairovirus）。该病毒最早于1910年在肯尼亚内罗毕被发现，长期以来被认为仅在非洲的小型反刍动物间传播。然而，1969年从印度奥里萨邦的绵羊身上分离到的甘贾姆病毒被证实是NSDV的亚洲变种，并可感染人类，揭示了其人兽共患的潜在风险。NSDV感染可导致绵羊和山羊出现严重的出血性胃肠炎、流产，死亡率高达70%以上，给畜牧业造成重大经济损失。尽管中国已在吉林、湖北、辽宁等地从长角血蜱中检测到NSDV核酸，但目前国内仍缺乏标准化的商品化分子检测试剂盒。现有诊断方法如酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）存在定量范围窄、易与克里米亚-刚果出血热病毒糖蛋白C发生交叉反应等问题。因此，亟需建立一种灵敏、特异、快速的分子检测工具，用于NSDV的诊断和流行病学监测，以有效防控这一被忽视的蜱传人兽共患病。
主要关键技术方法
本研究采用了两步法逆转录定量实时PCR（reverse-transcription quantitative PCR，RT-qPCR）策略。首先，研究人员针对NSDV小（small，S）基因的保守区域设计了一对特异性引物和一条TaqMan探针。其次，将目标S基因片段克隆至pMD18-T载体构建标准质粒，用于绘制标准曲线和确定检出限（limit of detection，LOD）。随后，对引物浓度、探针浓度和退火温度进行了优化，确定了最佳反应体系。在方法验证方面，评估了该方法的特异性（使用其他相关病原体核酸）、灵敏度（通过系列稀释标准质粒）和重复性（计算批内和批间变异系数）。最后，将该方法应用于实验感染绵羊的组织病毒载量分析和现场流行病学调查，后者样本来源于2023-2026年间中国黑龙江省六个地区（齐齐哈尔、大庆、哈尔滨、绥化、牡丹江、鸡西）采集的955份绵羊样本（包括鼻拭子、血清和粪便）和694只游离蜱虫，并对阳性样本进行S基因全长测序和系统发育分析。
研究结果
3.1 RT-qPCR方法的优化
通过矩阵法优化，确定最佳反应条件为：95°C预变性30秒，随后40个循环的95°C变性5秒和60°C退火延伸30秒。最佳20微升反应体系包含10微升2×Premix Ex Taq、各0.4微升10微摩尔/升的正反向引物、0.6微升10微摩尔/升的探针、2微升模板和去离子水。
3.2 标准曲线的建立
以1×108至1×102拷贝/微升的7个梯度标准质粒构建标准曲线，其方程为y = -3.301x + 33.742，决定系数（R2）为1，扩增效率为100.877%。
3.3 特异性分析
该RT-qPCR方法仅对NSDV阳性对照产生特异性扩增信号（Ct值小于36），而对小反刍兽疫病毒、发热伴血小板减少综合征病毒、白蛉热病毒、汉坦病毒和汉城病毒的cDNA以及阴性对照均无扩增，表明无交叉反应。
3.4 灵敏度分析
该方法的检出限（LOD）为10拷贝/微升。经三批次独立实验（每批次20次技术重复，共60次重复）验证，100拷贝/微升和10拷贝/微升浓度的阳性率均为100%（Wilson 95%置信区间：93.98%-100.00%），而1拷贝/微升浓度的阳性率仅为65%，符合MIQE指南中≥95%阳性率的LOD定义标准。
3.5 重复性和重现性
对于107、105和103拷贝/微升三个浓度的标准质粒，批内变异系数范围为0.29%至0.98%，批间变异系数范围为0.92%至0.93%，均低于1%，表明该方法具有良好的稳定性和重现性。
3.6 RT-qPCR在NSDV感染绵羊各器官病毒定量中的应用
在感染后第3天和第7天，研究人员在实验感染绵羊的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、十二指肠、空肠、直肠、盲肠、回肠和淋巴结等11种组织中均检测到NSDV核酸。统计分析显示，脾脏和肺中的病毒载量显著高于其他组织。在感染后第3天，一只感染绵羊的脾脏中检测到的最高病毒RNA载量为104.428拷贝/毫克。到感染后第14天，所有组织的病毒RNA载量急剧下降，至第28天，该RT-qPCR方法在所有受检器官中均未再检测到NSDV RNA。
3.7 NSDV流行病学分析结果
2023-2026年间，在黑龙江省六个地区的绵羊样本中，NSDV RNA总检出率为3.46%（33/955），其中血清样本检出率最高（5.30%，30/566），其次是鼻拭子（0.76%，2/264）和粪便样本（0.80%，1/125）。蜱虫样本的总检出率为2.88%（20/694）。不同地区检出率存在差异，绵羊样本中绥化（6.17%）和牡丹江（5.65%）较高，而鸡西未检出；蜱虫样本中绥化（5.16%）和齐齐哈尔（4.14%）较高，大庆未检出。
3.8 NSDV的系统发育分析
研究人员从一个蜱虫样本中获得了一条新的S基因核苷酸序列，命名为NSDV/HLJ-1/tick/China/2023。系统发育分析显示，该序列位于中国NSDV进化支内，并形成一个独立分支，与2019年中国SZWH2毒株的核苷酸序列同源性最高（94%），而与经典海外NSDV序列亲缘关系较远。
讨论与结论
讨论部分指出，气候变化扩大了多种蜱传病原体的地理分布，而蜱虫作为哨兵宿主在疾病传播中至关重要。尽管本研究建立的TaqMan RT-qPCR方法具有高灵敏度、特异性和重复性，但仍存在一些局限性。例如，每个地区仅采样1-3个邻近农场，存在聚类效应，无法将地区检出率外推至整个行政区。此外，用于NSDV RNA检测的蜱虫样本未进行物种鉴定，横断面数据无法确认蜱虫的媒介能力。病毒载量的定量是基于质粒DNA进行的，未考虑RNA提取和反转录过程中的损失，可能低估真实病毒载量。未来工作需要扩大监测范围，结合血清学检测，并尝试从阳性样本中分离病毒以进一步表征流行毒株的生物学特性。
研究结论部分翻译如下：
在本研究中，成功建立了一种灵敏且特异的基于TaqMan探针的RT-qPCR检测方法用于NSDV检测，为流行病学监测提供了可靠的实验室工具。动物攻毒实验显示，脾脏和肺中检测到最高的NSDV RNA载量，并且到感染后第28天，该RT-qPCR方法在多种组织中不再能检测到病毒RNA。现场调查揭示了黑龙江省绵羊群体中存在零星、低水平的NSDV循环。绵羊RNA阳性率与蜱虫核酸携带率之间存在区域性一致，提示蜱虫可能参与了NSDV的局部维持。系统发育分析显示，NSDV/HLJ-1/tick/China/2023序列在已报道的中国NSDV序列中形成一个独立分支，表明其与国内其他NSDV序列存在遗传分化。研究结果强调了在高风险地区加强针对性监测和媒介管理以减少这种被忽视的蜱传虫媒病毒传播风险的必要性。
